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インフルエンザウイルスRNAポリメラーゼのPB1サブユニットと相互作用する宿主因子
岡本拓人1),2)、本田文江1),3)、岩田晃4)、鈴木康夫2)、石浜明1)
1)国立遺伝学研究所、2)静岡県立薬科大学、3)科学技術振興事業団、4)日本生物科学研究所
第23回 日本分子生物学会
要旨：インフルエンザウイルスのゲノムはマイナス鎖RNAからなり、ゲノムの複製･転写はゲノムにコードされている3種類のサブユニット、PB1、PB2及びPAからなるRNA依存RNAポリメラーゼでなされる。PB1はRNA合成活性、PB2は宿主細胞mRNAのcap1構造を認識し結合する活性を持っている。PAの機能については明らかでない。ウイルスRNAポリメラーゼは鋳型RNAから2種類のRNA、mRNAと複製中間体のcRNAを合成する。mRNA合成はプライマーに依存しているがcRNA合成はde novoに開始される。一種類のポリメラーゼの機能変換には宿主因子の関与が想定される。私達はポリメラーゼと相互作用する宿主因子を酵母two-hybrid systemを利用してスクリーニングを行った。いくつかの候補の中でPB1と相互作用する因子PB1c54について、in vitro転写への影響と細胞内局在を報告し、細胞に於ける機能及びウイルス感染に対する影響を論じたい。
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Technological Development for Detection of Animal Materials in Feed in Japan
Kawashima,T.1), Enishi,O.1), Tajima,K.1), Amari,M.1), Hosokawa-Kanai,T.2),
Tuchiya,K.2), Toyoda,T.3), Kawachi,H.3), Matsui,T.4) and Yano,H.4)
1)National Institute of Livestock and Grassland Science
2)Nippon Institute for Biological Science 3)Ibaraki University 4)Kyoto University
International Symposium on "Food and feed safety in the context of prion diseases"Namur,Belgium,2004.
Abstract：The methods applied for detection of animal materials in feed, such as microscopic examination, near infrared reflectance spectroscopy (NIRS), ELISA technique and DNA technology (PCR) are being improved time to time and there is no common techniques internationally accepted. In Japan, authorized agencies are conducting an examination of contamination of animal materials in feed by the combination of microscopic examination, PCR and ELISA. While, we have initiated a research project to develop/upgrade detection methods of animal materials in feed as for evaluation of feed safety in relation to BSE, which involves in NIRS, ELISA, PCR and DNA chip. Current outcomes are outlined in this report.
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犬パルボウイルス（CPV）および犬コロナウイルス（CCV）感染症の迅速診断法の開発
細川朋子，土屋耕太郎，上田進
日本生物科学研究所
第137回 日本獣医学会（2004年）
要旨：［目的］イヌパルボウイルス（CPV）およびイヌコロナウイルス（CCV）はイヌの消化器疾患に関与する代表的なウイルスである。CPVは病原性が強く、死亡率も高いことから、早期診断・早期治療が重要である。一方、CCVは死亡率が低く、予後も比較的良好とされるが時折重症例も認められ、野外においては伝播力が強いことから、CPVとの早期鑑別診断が臨床上きわめて重要である。そこで、CPVあるいはCCV感染症を同時に早期診断することを目的として、イムノクロマト法による診断キットを作製し、その有用性を検討した。［材料と方法］精製CPVおよび精製CCVを免疫原として、それぞれに対するモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を作製した。精製抗体を固相化または金コロイド標識し、イムノクロマトキットを作製した。CPVについては3種類の亜型（2型、2a型、2b型）に対する反応性を検討した。さらに、CPVおよびCCV感染試験を約2ヵ月齢あるいは約1 歳齢のビーグル犬を用いて行い、感染後2週間の排泄ウイルス検出を行った。本キットによるウイルス検出結果を、CPVについては豚赤血球凝集試験（HA）、CCVについてはPCRおよびELISAによる検出結果と比較検討した。［結果と考察］本キットは、CPV検出においては3種類全ての亜型を検出できることを確認した。CPV感染試験では感染4～5日目から約5日間、特徴的な臨床症状を呈した全例でウイルス排泄が認められ（HA価16～5120倍）、これら検体からの本キットによるウイルス検出が可能であった。CCV感染試験では感染1～2日目から約2週間、軽い下痢の症状とともに全例でウイルス排泄が認められた。個体間および経過内でのCCV排泄量にはバラツキがあったが、本キットでは半定量的に検出が可能と考えられた。本試験により、今回試作したキットがCPVおよびCCV感染症の早期診断に有用であることが示された。今後、野外例を含めて、さらに有用性を検討して行く予定である。
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牛プリオンタンパク質に対する新規抗体の作製と有用性の検討
細川朋子1)、土屋耕太郎1)、山河芳夫2)、佐多徹太郎2)、小野寺節3)、上田進1)
1)日本生物科学研究所、2)感染症研究所、3)東京大学大学院農学生命科学研究科
第138回 日本獣医学会（2004年）
要旨：［目的］BSE検査における異常なプリオンタンパク質（PrP）の検出には多くの抗体が使用されているが、非定型あるいは若齢牛のBSEや肥飼料原料などからの高感度検出に対応するためには、牛PrP抗体パネルの充実が必要である。本研究では、新規に作製した抗牛PrP抗体の性状を報告する。［材料と方法］大腸菌発現牛PrP（rbPrP）あるいは合成ペプチドをプリオンレスマウスに免疫し、7個のモノクローナル抗体（mAb）を作製した。各抗体についてELISAおよびウエスタンブロット法（WB）により牛正常PrPとの反応性を検討した。反応性の高いmAbについてはエピトープ解析を行った。さらに2個のmAbを用い、牛PrP検出系の確立を試みた。［結果と考察］mAbのアイソタイプは5個（2B11、2D8、4B5、6C4、6G3-2）がIgG1、2個（1D12、17F11）がIgG2aであった。いずれもWBでの反応性は高く、ELISAでの反応性は2D8以外では同程度に高かった。5個のmAb（1D12、2B11、4B5、6G3-2、17F11）のエピトープ解析を行い、2カ所3種類のエピトープを確認した。2個のmAb（6G3-2、17F11）を用いた牛PrP検出系では、精製rbPrPを数pg/mLのレベルまで検出できた。現在、これらのmAbの異常PrPに対する反応性を免疫組織化学染色法により検討している。これらの成績より、本研究で作製した抗体は、異常PrPの検出に貢献できると考えられた。本研究の一部は「先端技術を活用した農林水産研究高度化事業」の一環として行なった。本研究にプリオンレスマウスを提供していただいた糸原重美先生（理化学研究所）に深謝いたします。
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不活化狂犬病ウイルスの経鼻免疫による狂犬病防御免疫の誘導
米田篤史1)、土屋耕太郎2)、高島康弘1)、新川武3)、辻尚利4)、林 良博1)、松本安喜1)
1)東京大学・院農・国際動物資源科学、2)日本生物科学研究所、3)琉球大・遺伝子実験セ、
4)動物衛生研究所
第138回 日本獣医学会（2004年）
要旨：【背景と目的】粘膜系免疫法は低侵襲性の免疫法として期待されている。我々は、これまでにオーエスキー病(第130回本学会)、豚回虫症(第131、134、136回本学会)などの感染防御に経鼻免疫が有効であることを示してきた。本研究では、不活化狂犬病ウイルスの経鼻免疫による狂犬病防御免疫誘導の可能性を検討した。【材料と方法】免疫抗原は、狂犬病組織培養不活化ワクチン(日生研)を、超遠心法で濃縮し(CRV)使用した。このCRV 30μlを単独あるいはCholera toxin (CT) 5μgと共に6週齢雌ddyマウスに経鼻投与し、更に初回投与後14、21、28、35日目に追加免疫した。42日目に血清を採取した後、致死量(46LD50)の狂犬病ウイルスCVS株で脳内から攻撃し14日間生死を観察した。対照群としてCRV30μlを2回腹腔免疫した群および非免疫群を設定した。攻撃時の狂犬病ウイルスRC-HL株に対する血中中和抗体価をマイクロプレート法により測定した。【結果と考察】攻撃試験では、CT添加CRV経鼻免疫群で6頭中4頭(67%)のマウスが生残し、CRV単独経鼻免疫群では6頭中1頭(17%)のマウスが生残した。CRV腹腔免疫群は全頭生残し、非免疫群は全頭死亡した。CT添加経鼻免疫群の血中中和抗体価は、640～20480倍であり、腹腔免疫群(5120～20480倍)より若干低い程度であった。一方、CRV単独経鼻免疫群では中和抗体価は検出されたものの、前述の2群よりも低値(80～2560倍)であった。以上の結果より、不活化狂犬病ウイルスを用いた経鼻免疫法により、狂犬病ウイルスに対する防御免疫が誘導されること、さらにCTの添加によりその誘導能が増強されることが示された。しかしながら、経鼻免疫の効率は、腹腔免疫より低く、免疫の効率化が課題であると考えられた。
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INTAKE OF SWEET AND BITTER SOLUTIONS：VARIATION IN INBRED STRAINS OF GOLDEN HAMSTERS
Frank, M.E.1), Wada,Y.3), Makino,J.3), Mizutani,M.4), Umezawa,H.4), Katsuie,Y.4),
Hettinger, T.P.2), and Blizard, D.A.2)
1)Neurosciences，Dept．Oral Diagnosis，UConn Health Center，
2)Pennsylvania State University，3)University of Tsukuba，
4)Nippon Institute for Biological Science
The national meeting of the association for chemoreception sciences 2004 in Sarasota FL USA.
Abstract：Intake of sweet and bitter solutions by 7 inbred strains of golden hamsters (Mesocricetus auratus)，a principal species for studies of mammalian gustatory systems，was measured．Two concentrations each of sucrose，maltose，D-Phe and Na saccharin，which are sweet；and quinine・HCl，L-Phe，caffeine and sucrose octaacetate (SOA)，which are bitter to humans，were tested．Difference scores，solution intake minus mean baseline water intake in mL (DIF) were evaluated by analysis of variance (α=.05）．Compared to ACN，CN，APA，APG and CBN (5 strains with similar DIF for all tested solutions)，GN (an ACNT ancestral strain) and ACNT preferred sucrose，caffeine and SOA more strongly；ACNT also preferred saccharin and maltose more strongly and rejected quinine more strongly．There were no strain differences in DIF for D-Phe and L-Phe．Narrow sense heritabilities for the 6 compounds for which strain differences were revealed ranged from 0.31 to 0.57．Cluster analysis of genetic correlations indicated the strain variations in intake of sucrose，saccharin，SOA and caffeine were coupled，an association with several possible interpretations．The genetic differences that influence taste behaviors in existing strains of hamsters may help identify relevant genes．[Supported by NIH grant R01 DC04099 and Japan Society Senior Fellowship (DAB)]
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EMBRYO CULTURE SYSTEM OF CHINESE PAINTED QUAIL FOR DEVELOPMNETAL ENGINEERING
Ono,T.1), Nakane,Y.2), Wadayama,T.1), Tsudzuki,M.3), Arisawa,K.1), Ninomiya,S.1), Suzuki,T.4), Mizutani,M.5) and Kagami,H.1)
1)Faculty of Agriculture，Shinshu University，
2)Graduate School of Medicine，Kyoto University，
3)Faculty of Applied Biological Science，Hiroshima University，
4)Juuior College，Toyama Prefectural University，5)Nippon Institute for Biological Science
XXⅡ World's Poultry Congress in Istanbul Turkey 2004.
Abstract：The Chinese painted quail (Excalfactoria chinensis)， the smallest species in the family phasianidae，is one of the candidates for a model animal for avian developmental engineering because it is precocious and prolific．This species requires 17 days to hatch and 8-9 weeks to mature to an adult body weight of about 50 g，while the Japanese quail (Coturnix japonica) requires 16 days to hatch and 6-8 weeks to mature to an adult body weight of 100-150 g．The early embryo is the most challenging embryonic stage of avian biotechnology in terms of its culture and manipulation．In this study we examined the optimal conditions for culturing Chinese painted quail embryos from the blastoderm stage to hatching．The embryo culture consisted of two steps．In the first step，embryos with egg yolk and albumen were removed from the eggshells．The thick albumen capsule was removed from the egg yolk，and the egg yolk was transferred to a surrogate eggshall of Japanese quail．The shell was filled with thin albumen of chicken eggs，sealed tightly and incubated at 37.5℃ and 70% relative humidity while being rocked around the long axis at a 90 degree angle at 30-min intervals．High viability of the embryos (90% 35/39) after 50-52 hr of culture was obtained．The embryos cultured in the first step were transferred to small shells of chicken eggs (second step)．The culture conditions were similar to those in the first step except that the open surface sealed by cling film was directed upward and the rocking was done round the short axis of the shell at a 30 degree angle．One or two days before the expected hatching time，the film was perforated to facilitate embryonic respiration．Just before hatching，rocking of the embryos was stopped．A hatchability rate of 25.6% (10/39) was obtained and the procedure developed here should be highly useful in poultry biotechnology．
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Construction of linkage map in Japanese quail (Coturnix japonica) using AFLP，functionnal gene，and chicken microsatellite markers
Fujikawa,D.1), Hinenoya,T.2), Kikuchi,S.1), Mizutani,M.3), Tsuji,S.2) and Mannen,H.2)
1)Graduate School of Science and Technology，Kobe University，
2)Faculty of Agriculture，Kobe University，3)Nippon Institute for Biological Science
29th International Conference on Animal Genetics ISAG2004/TOKYO
Abstract：Japanese quail has been used not only as meat and egg producer but also as laboratory animal because of its small body size，short generation intervals and high egg production．However，the genetical information is so limited and the saturated linkage map has not been constructed yet．In this study，we established backcross resource family using two Japanese quail lines；a muscular disorder (LWC) and neurofilament-deficient mutant (Quv) quail line．Subsequently，the linkage map was constructed by AFLP，functional gene and chicken microsatellite markers．In total，1933 AFLP，25 microsatellite and 10 functional gene markers were developed in Japanese quail reference family．By linkage analysis at LOD threshold of 3.0 using these markers and three phenotypic markers (Quv，LWC and sex)，1883 of the markers were distrbuted into 58 linkage groups and the remaining 88 markers were unlinked．But since duplication of markers existed in many loci，the number of substantive loci was 662．The current map has a total length of 3383．1cM．The average interval between two adjacent loci was 5.1cM．Especially，strong syntecy between the linkage group 2 and chicken chromosome 2 was observed through the chromosome．The Quv was located on the linkage group 6，while the LWC was not linked with any linkage groups．
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Muscular dystrophy candidate gene in chicken genome
Kikuchi,S.1), Yoshizawa,K.4), Kikuchi,T.2), Mizutani,M.3), Tsuji,S.2) and Mannen,H.4)
1)Graduate School of Science and Technology，Kobe University，
2)Department of Animal Models for Human Disease，National Institute of Neuroscience，
3)Nippon Institute for Biological Science，4)Faculty of Agriculture，Kobe University
29th International Conference on Animal Genetics ISAG2004/TOKYO
Abstract：Our recent studies revealed that the genetic locus for chicken muscular dystrophy (cMD) of abnormal muscle (AM) was mapped to chromosome 2q，and that the region showed synteny with the human chromosome 8q11-24.3．In this study，we attempted to map more functional genes，which located on human chromosome 8q，to chicken chromosomes．Twenty-three genes and ESTs were mapped to chicken chromosome 2 by linkage analysis using the Kobe University resource family．The AM locus was mapped between two genes (IMPA1 and CBGA2T1) whose interval was 1.9cM，and corresponded with six loci (FABP4， MMP16，DECR1，CGI-77 and MCW0166)．The functional genes in this region are the most likely candidate genes responsible for cMD．We performed northern hybridization using total RNA extracted from normal and cMD pectoralis to analyze the expression of 10 candidate genes．Three genes (DECR1，FABP4 and CA3) showed different expression．Both DECR1 and FABP4 showed higher expression in cMD than normal．They are associated with synthesis of fatty acid．In the cMD muscular tissues convert to fatty tissues，suggesting the higher expression by fat tissue．The CA3 expressed higher in normal than in cMD．In general，CA3 express higher in the muscle of muscular dystrophy．Therefore，these genes were not considered as the responsible gene of cMD．
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ニホンウズラにおける劣性黒色羽装を示すミュータントウズラについての遺伝子分析
藤原哲1)、水谷誠1)，小野珠乙2)，鏡味裕2)
1)日本生物科学研究所、2)信州大学農学部
日本家禽学会2004年度秋季大会
要旨：【目的】当研究所において維持しているニホンウズラTKP系において羽装が黒色を示すミュータントが出現した。しかしこのミュータントの形質を支配する遺伝子解析はほとんど成し遂げられていない。そこで、このミュータントの遺伝子分析を目的として本研究を行なった。【材料および方法】野生型ニホンウズラでは、孵化時の羽装黄褐色で背中に縦隔模様が存在する。しかし、本研究に用いたミュータントでは、孵化時は全身黒色で野生型と同様に背中に縦隔が入り、脚は黒色である。この表現型の差異によって、野生型ウズラとは識別可能である。また、性成熟の際、全身が黒色であるため、野生型ウズラのように胸の羽装による雌雄鑑別ができない。そこで本ミュータントの遺伝的特性を解明するためミュータントウズラと野生型WE系を交配し、遺伝子分析を行なった。【結果および考察】分析の結果、F1は68個体すべて野生型であった。次に、F1×F1の交配を行いF2におけるミュータントウズラの出現率を検索したところ、野生型44個体、ミュータント18個体となった。また、F1×ミュータントの戻し交配では、野生型42個体、ミュータント50個体が得られた。これらの結果は、本ミュータントが常染色体性の劣性遺伝子により交配されていることを示した。この遺伝子記号をｒｂと命名した。今後、既に報告されている常染色体性の優性遺伝子に支配され、本ミュータントと同様な羽装を示すミュータントBK系との交配実験を行い、分析を行なっていく予定である。産卵成績に関しては、他の系統と比較した場合少し低い。また、受精率、孵化率においても、WE系を含む他の系統と比較した場合、少し低い傾向にある。これらの点についても今後解析する予定である。
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ニワトリのドーパミン受容体D4 exon 1 相同領域における多型
杉山晃規1)、井上-村山美穂1)、三輪充1)、Kayang, B.B.2)、大橋里也子1)、植田祐子1)、
水谷誠3)、韮澤圭二郎4)、尾台昌治4)、峰澤満5)、渡辺茂6)、伊藤愼一1)
1)岐大農、2) INRA、3)日本生物科学研究所、4)畜草研、5)生物研、6)慶大文
第103回 日本畜産学会（2004年）
要旨：【目的】家畜・家禽の行動特性は、飼育管理や生産性に大きく影響する。行動特性の違いが、近年、ヒトで報告されているような神経伝達物質関連遺伝子の違いに起因するならば、遺伝子を指標とした選抜が可能になると考えられる。演者らは、これら遺伝子のうち、ヒトの神経疾患に関与するドーパミン受容体D4 exon 1相同領域を、鳥類で増幅し、多型解析を行った。【方法】キジ科に属するニワトリ（12品種）、うずら、ホロホロチョウ、コウライキジ、およびアウトグループとしてウミウとハシブトガラスで、exon 1 相同領域をPCR増幅し、塩基配列を解析した。【結果】家禽では、ヒトの多型領域に相当する部位に、ニワトリで9回と8回、ウズラで9回、ホロホロチョウで12回、コウライキジで9回のプロリンの反復が存在していた。ニワトリのアロウカナと土佐地鶏の各10個体では反復数9回、黒色ミノルカ22個体では反復数8回のアレルが見出された。対馬地鶏と比内鶏では9回と8回の両方が見出された、ウミウでは9回、ハシブトガラスでは3回の反復が確認された。今回発見された多型は、ニワトリの行動特性の個体差や品種差の遺伝的背景の解明の重要な情報になると考えられる。
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イヌにおけるインターフェロンの応用 ―3つのアプローチ―
岩田晃
日本生物科学研究所
第２回 動物サイトカイン研究会 平成16年（2004年） 特別講演
要旨：インターフェロン（IFN）は抗ウイルス作用等、多様な生物活性を持つサイトカインである。人体用ですでにC型肝炎、B型肝炎の治療に主に用いられ、かなりの成果を挙げている。また、イヌ、ネコに対してもネコIFN-ωが実用化されている。今回、農林水産省研究プロジェクト「組換えサイトカインによる家畜疾病防除技術の開発」で我々の行ってきた検討について紹介し、あわせて今後の展望などについて考察したい。
(1) 精製タンパク質の応用
タンパク質を精製し、医薬品として用いるにはコストがかかるが、製剤としてコントロールしやすい。また、実用化されているIFN製剤はすべて精製タンパク質を原薬としている。我々はイヌIFN-α１、βおよびγの遺伝子をクローニングし、精製のためHis-tagを付加してバキュロウイルスベクターを用いて生産した。感染培養上清中のIFN活性は、それぞれ、約40万LU/ｍL、10万LU/ｍLおよび2万LU/ｍLであった。IFN-γはNi-NTAカラムで精製できなかったが、IFN-α１、βは純度90％以上に精製され、比活性はいずれも107LU/ｍｇタンパク質であった。イヌに106LU/ｋｇで投与したところ、体温上昇や２－５A合成酵素の誘導が認められた。
(2) ウイルスベクターへの応用
IFNは抗ウイルス作用があるので、ウイルスに組み込んで発現させると弱毒化因子として働く。我々はモデルとしてイヌIFN-β、γ遺伝子を組み込んだワクチニアウイルス（VV）を構築した。組換えVVはウサギ腎臓細胞では親VVと同様に増殖するが、イヌ細胞では感染価が低moiのときに増殖せず、弱毒化していると推測された。抗IFN-γ中和抗体存在下では、IFN-γを生産する組換えVVの増殖が回復した。組換えウイルスベクターを利用するには環境へ放出しなければならない。カルタヘナ法における環境影響調査の運用が実用化の鍵であろう。
(3) IFN誘導剤の応用
センダイウイルスリポソーム（GenomOneTM）を利用したDNA導入法を検討中、GenomOneTM単独で2-5A合成酵素がIFN-α投与と同じ程度に誘導されることが見出された。血清中には検出限界程度のIFNが認められるに過ぎなかったが、GenomOneTMはIFN誘導剤と考えられた。IFN誘導剤の応用は人工二重鎖RNAが臨床で検討された。副作用が強く、実用化は１例に過ぎない。しかし、最近のNDVを利用したoncolytic治療などでは、IFNを含む複数のサイトカインが有効に抗腫瘍効果を発揮している。IFN誘導剤のinnate immunity活性化における再評価が課題ではないか。 IFNは長野・小島により報告されて今年で50年になる。この間、IFNについて多くの研究がなされたが、いまだに新しい生物活性が報告されている。本報告がサイトカインを応用した製剤開発のヒントを提供できれば幸いである。
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NIBS系ミニブタの生物学的背景データ
北條隆男、斎藤敏樹、藤井哲夫、坂本裕二、矢澤肇
日本生物科学研究所
第51回 日本実験動物学会総会（2004年）
要旨：【背景と目的】近年、ミニブタは異種移植、再生医療など医学分野での研究のほか、薬効・薬理試験などにおいても利用され始めている。NIBS系ミニブタはピットマンムーア系、タイワン小耳種、ゲッチンゲン系３種類のミニブタを起源とする小型で均整がとれた白毛色ミニブタである。我々はNIBS系ミニブタを様々な研究分野への応用するために生物学的背景データを収集している。今回、そのデータの一部、ならびにミニブタではあまり報告されていない薬物代謝あるいは動態成績について報告する。【材料と方法】実験動物部で繁殖している健康なNIBS系ミニブタを用いて体重および繁殖成績を収集し、月齢を追って採血し血液学的検査および血液生化学的検査行った。さらに、肝マイクロソームを調製し、チトクロームP450（CYP）含量および薬物代謝酵素活性（エトキシレゾルフィン-O-脱エチル化活性、トルブタミド水酸化活性およびミダゾラム-4-水酸化活性）を調べた。【結果と考察】出生時体重は雄が雌より高値を示したが、1ヶ月齢以後の体重は雌が雄よりも高値を示した。産児数は約4匹/腹、離乳児数は約3匹/腹であった。血液学的検査および血液生化学的検査において雌雄間で大きな差が認められた検査項目はなかった。薬物代謝・動態の検査成績においてアンチピリンの全身クリアランス、CYP含量は雌雄でほぼ同様の値を示したが、雄の薬物代謝酵素活性は雌より低値傾向を示した。アンチピリンの全身クリアランスはヒトでの報告値と同様であった。ミダゾラム-4-水酸化活性はCYP3Aのプローブとして知られているが、得られた結果はヒトとほぼ同様の値であった。CYP3Aはヒトにおいて薬物代謝上最も重要な分子腫の一つであること、アンチピリンの全身クリアランスがヒトと同様であったことから、ミニブタは薬物代謝、動態研究においてヒトのモデルとして有用であると考えられた。
Biological reference data in NIBS miniature-pigs (NIBS mini-pigs)
Abstract：Recently, miniature-pigs have been widely used not only in medical researches including heterotransplantation and regeneration medicine, but also in drug efficacy and pharmacological studies. NIBS mini-pigs are originated from 3 strains (Pitman-Moore, Taiwan Small Ear and goettingen). Now, we report a part of the biological reference data and drug metabolism and pharmacokinetic data in NIBS mini-pigs. Data of body weight (BW), reproductive performance, hematological and blood biochemical parameters, and total body clearance of antipyrine (CLtot) were collected from healthy NIBS mini-pigs breaded in our facility. Furthermore hepatic microsomes were prepared to measure total cytochrome P450 (CYP) content and CYP activities. BW of male pups at birth was heavier than that of females, in contrast, BW of females was heavier than that of males after one month of age. In hematological and blood biochemical parameters, CLtot and total CYP content, significant differences between males and females were not observed. CLtot in NIBS indicated almost same values in humans. Midazolam 4-hydroxylation is known to be probe for CYP3A, and this activity indicated almost same value in human. Since CYP3A is one of the most important CYP subfamily in drug metabolism, it was considered that NIBS mini-pig is applicable to research of drug metabolism and pharmacokinetics for humans.
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注射針を用いた骨髄細胞数の簡便測定法
松本清司1)、斎藤敏樹2)、劉芳1)、藤井哲夫2)、石川孝之2)、北條隆男2)
1)信州大学ヒト県境科学研究支援センター、2)日本生物科学研究所
第51回 日本実験動物学会（2004年）
要旨：安全性試験、特に血液・骨髄毒性や免疫毒性の評価において、骨髄細胞数の測定は重要なパラメーターの一つである。骨髄細胞数の測定には、これまではメランジュールを用いる容積法あるいは大腿骨から全ての骨髄を取り出す重量法などが用いられてきた。今回、我々は従来の方法に比べ簡便かつ短時間で骨髄細胞数が測定できる方法を確立した。ラットを安楽死させ大腿骨を摘出して大腿骨頭の一端を切断した。予め18Ｇの注射針の重量を電子天秤で秤量し、この注射針をシリンジに取り付け針を大腿骨内へ挿入した。骨髄液を軽く吸引した後、針を外して重量を秤量しこの重量差を骨髄量とした。再度、針をシリンジに取り付け緩衝生理食塩液中で吸引排出を繰り返して細胞浮遊液とし、自動血球計数装置の白血球モードで細胞数を測定した。この方法を用いて、SD、BNおよびMESラット（体重範囲：53～418 g）について左右大腿骨の骨髄細胞数を測定した。加えて4、5、6および10週齢の雌雄SDラットの骨髄細胞数を測定し、本法と従来より汎用されてきたメランジュール法との比較を行った。1回の吸引骨髄量は約10～20mgであった。SD、BNおよびMESラットの左右の大腿骨における骨髄細胞数はほぼ同じ値を示し、既報の成績と一致した。SDラットの4、5、6および10週齢における骨髄細胞数はそれぞれ雄で2.72、2.39、2.26および1.96（×106個/mg骨髄）、雌で2.75、2.47、2.38および1.98（×106個/mg骨髄）であった。以上の結果から、我々が確立した骨髄細胞数の測定方法は体重が約60g以上の動物であれば適用可能であること、左右どちらの大腿骨を用いてもほぼ同様の値が得られること、メランジュールの方法と比べて加齢に伴う変化にも大きな差はないことが明らかとなった。このことから本法は安全性試験のみならず、小動物の骨髄細胞数を測定する方法として有用であると考えられた。今後更に例数を増やすとともに安全性試験に応用する予定である。
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注射針を用いた骨髄細胞数の簡便測定法の毒性評価への応用
松本清司1)、斎藤敏樹2)、劉芳1)、藤井哲夫2)、石川孝之2)、北條隆男2)
1)信州大学ヒト県境科学研究支援センター、2)日本生物科学研究所
第31回 日本トキシコロジー学会（2004年）
要旨：安全性試験、特に血液・骨髄毒性や免疫毒性の評価において、骨髄細胞数は重要なパラメーターの一つである。我々は従来の骨髄細胞数測定法（メランジュール法など）に比べ、簡便かつ短時間で正確に骨髄細胞数が測定できる方法を確立した。その方法の概略とそれを用いた実験成績について報告する。ラットから大腿骨を摘出後大腿骨頭の一端を切断し、予め18Ｇの注射針の重量を測定後、この注射針をシリンジに取り付け針を大腿骨内へ挿入した。骨髄液を針内に吸引した後、針の重量を測定し、この重量差を骨髄量とした。再度、針をシリンジに取り付け緩衝生理食塩液中で吸引排出を繰り返して細胞浮遊液とし、自動血球計数器で細胞数を測定した。この方法を用い、SD、BN、MESラット（体重範囲：53～418 g）における左右大腿骨の骨髄細胞数の差、および4～10週齢の正常SDラットの骨髄細胞数を調べた。また、G-CSF（0、2および6 U/kg/day）をラットに4日間皮下投与し、骨髄への影響の評価における本法の有用性を検討した。SD、BN、MESラットにおいて左右大腿骨の骨髄細胞数にほとんど差はなく、SDラットの4、5、6、10週齢における骨髄細胞数はそれぞれ雄で2.72、2.39、2.26、1.96、雌で2.75、2.47、2.38、1.98（×106個/mg 骨髄）であった。G-CSF投与の結果、骨髄細胞数は微増したが有意差はみられなかった。骨髄塗抹細胞検査により、G-CSF投与群で好中球（分葉核および桿状核）の増加が認められ、細胞の構成比の変化が確認された。以上のように、本法は体重が約60g以上の動物であれば適用可能であること、左右大腿骨間の骨髄細胞数に差はないことが示された。G-CSF投与実験から、本法と骨髄塗抹細胞検査と併用することで骨髄毒性に関する有用な情報が得られることが明らかとなった。
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ミニブタ（NIBS系）を用いた過剰排卵誘起の検討
石川孝之1)、坂本裕二1)、阿久津祐一1)、新海久夫1)、勝家康富1)、矢澤肇1)、藤原哲11)、
唐澤茂1)、水谷誠1)、上田英登2)、黒目麻由子2)、富井亮2)、長嶋比呂志2)
1)日本生物科学研究所、2)明治大学農学部
第51回 日本実験動物総会（2004年）
要旨：良質な初期胚を安定して確保するための過排卵誘起法は、胚操作を伴う発生工学研究を支える重要な基盤技術である。本研究では、当研究所で維持するミニブタ（NIBS系）に対する効率的な過排卵誘起法を検討した。供試動物として若齢豚9頭および未経産豚20頭を用いた。若齢豚は、eCG (800 IU)投与68時間後にhCG (500 IU)を投与した。一方、未経産豚は、妊娠25~40日にPGF2αで発情周期を同期化し、eCG (500 IU)投与68時間後にhCG (300 IU)を投与するグループIとeCG (500 IU)・hCG (150 IU)を投与するグループIIおよびeCG (250 IU)・hCG (150 IU)を投与するグループIIIを試みた。hCG投与48時間後に卵管灌流もしくは卵巣の排卵点を計測して排卵数を確認した。さらに、排卵卵子の一部に単為発生を誘起して胚盤胞期胚への発生率を調べた。若齢豚を用いた試験区では、既発情および未発情豚（3.5ヵ月齢以下）に排卵が誘起されなかったのに対して、初回発情直前の4ヶ月齢豚で過排卵が誘起された（18.7±3.8個/頭）。未経産豚においては、グループIIで効率良く過排卵が誘起された（15.1±5.2個/頭）。また、単為発生卵は、30%が胚盤胞期胚へと発生した。以上の結果は、ミニブタ（NIBS系）を用いた発生工学的研究上極めて有用な知見であると思われる。
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組換えイヌG-CSFのBrevibacillus chosinensisによる発現と精製
山元哲、岩田晃、斎藤敏樹、渡邊史子1)、上田進
日本生物科学研究所、1)ヒゲタ醤油（株）
第137回 日本獣医学会（2004年）
要旨：好中球分化を促進する顆粒球コロニー刺激因子(G -CSF)は癌化学療法の補助剤などに臨床応用されている。我々は、イヌの好中球減少に対する治療薬を開発することを目的としてBrevibacillusの系で組換えイヌG -CSFを分泌発現させ、精製し、生物活性を確認した。発現プラスミドpNY326のシグナルペプチドの下流に成熟イヌG -CSFcDNA、もしくは17番目のシステイン残基をセリンに置換したcDNA(イヌG-CSF（C17S）)を組込み、Brevibacillus chosinensis HPD31株へと導入した。組換えG-CSFの上清への分泌を抗ネコG-CSF抗血清を用いたWestern blotおよびNFS-60細胞の増殖による生物活性測定で確認した。Western blotより推定したタンパク質量あたりの生物活性はイヌG-CSF(C17S)の方が10倍高く、バキュロウイルス発現ネコG-CSFおよび市販のヒトG-CSFと同程度であった。 組換えイヌG-CSF(C17S）を含む培養上清を硫安沈殿により濃縮し、疎水性カラム、イオン交換カラム精製を行って、精製品（比活性：107U/mgタンパク質）を得た。 精製品をイヌ（体重約10ｋｇ）に125、25、5、1μg/headの用量で各群2頭づつ2日間連日、皮下注射で投与した。血中の総白血球数は投与1日後から全ての群で上昇した。このうち、全ての群で好中球数が、また、125、25、5μg投与群でリンパ球および単球の数が上昇した。投与中止後、抗中球数は速やかに元の値へと回復し、臨床症状は観察されなかった。
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Evaluation of Low Dose E2 Effects in Enhanced One-generation Reproduction Test Using Japanese Quail
Shibuya,K., Wada,M.1), Sato,K., Itabashi,M., Sakamoto,T.2) and Nunoya,T.
Nippon Institute for Biological Science, 1) Tokyo medical and Dental University,
2) Trans Genic, Inc.
SETAC 25th Annual Meeting in North America,2004.
Abstract：We have developed so-called avian enhanced one-generation reproduction test using the Japanese quail (Coturnix coturnix japonica) to detect endocrine disruption, based on the testing guidelines of avian reproduction toxicity test (OECD TG206 and ARTT2000). In the previous testing protocols, endpoints such as blood levels of test substance and vitellogenin (Vg), histopathology in parent birds, egg weight and eggshell strength, size of gonad, gross pathology, and histopathology in 14-day-old offspring were not included. Therefore, those endpoints were newly added.Moreover, offspring from the treatment week-2 eggs were maintained up to 10 weeks of age, and their viability, clinical signs, body weights, sizes of cloacal gland in males, age of the first egg laying, numbers of eggs laid and eggs with abnormalities, gross pathology, organ weights and body weight ratios, and histopathology were examined. Using this new testing protocol, low dose effects of 17 beta-estradiol (E2) were assessed.After the 2-week pre-treatment period, pairs of 10-week-old birds were fed a phytoestrogen-deficient diet containing E2 at 0 (control), 0.3, 3, and 30 ppm for 6 weeks.Blood Vg level, histopathology of the gonad and cloacal gland in parent birds, number of eggs with abnormalities, egg weight, fertility, hatchability, body weight, gross pathology and histopathology of the gonad in 14-day-old offspring, and body weight, gross pathology and histopathology of the gonad in offspring maintained up to 10 weeks of age revealed significant or meaningful changes in the low dose E2 groups. Furthermore, decreased weights of cloacal gland and delay of the first egg laying day were observed in offspring maintained up to 10 weeks of age in the E2 groups. Consequently, the enhanced one-generation reproduction test seems to be sensitive enough to detect low dose effects of estrogenic endocrine disrupting chemicals (The present study was supported by Ministry of the Environment, Japan).
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Sex Reversal Test Using a New Quail Model, F1(AWE x WE), is Useful to Assess Estrogenic Endocrine Activity as Tier 1 in vivo Screening
Shibuya,K., Sato,K., Mizutani,M., Wada, M.1), Shimada,K.2) and Nunoya,T.
Nippon Institute for Biological Science, 1) Tokyo medical and Dental University,
2) Nagoya University
SETAC 25th Annual Meeting in North America,2004.
Abstract：Tier 1 screening battery in birds for assessment of endocrine disrupting effects of chemicals has not been completed.There are a few candidates of in vitro and in vivoscreening method such as estrogen receptor binding assay, mRNA detection of vetellogenin (Vg) and very low density lipoprotein, and monitering of blood Vg level.We have developed a new in vivo screening method for evaluating estrogenic endocrine activity of chemicals using Japanese quail embryo. F1(AWE x WE) Japanese quail has been produced by mating between male AWE (albino plumage color) and female WE (wild plumage color) strains. The male and female F1 quail exhibit exactly wild and albino phenotypes, respectively, ruled by a criss-cross inheritance. Therefore, it is easy to determine genetic sex in the embryo stage. Using fertile eggs of F1(AWE x WE), 17 beta-estradiol (E2), ethynylestradiol (EE), diethylstilbestrol (DES), nonylphenol (NP), and bisphenol A (BPA) were assessed. Twenty micro-L of corn oil containing various doses of the test substances were injected in egg white just before the incubation. Control eggs received the same volume of corn oil alone. At 16 days of incubation, embryos were grossly observed and the gonad was processed to histological preparations.The incidence and degree of ovotestis were examined histopathologically as endpoints.Exposure of E2, EE and DES resulted in a dose-dependent increase in incidence and degree of ovotestis.Both NP and BPA also induced ovotestis with significantly higher incidences compared with the controls, whereas the incidence and degree were not dependent on dose levels. This in vivo screening method using F1(AWE x WE) is inexpensive,simple and can reduce time to achieve results, so that the screening method is a promising candidate to evaluate feminization effects of estrogenic endocrine disrupters in birds (The present study was partly supported by Ministry of the Environment, Japan).
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慢性呼吸器病が発生した養豚場におけるActinobacillus pleuropneumoniae及びMycoplasma hyopneumoniae不活化ワクチンの併用による効果
長井伸也、小山智洋、高橋欣也
日本生物科学研究所
第137回 日本獣医学会（2004年）
要旨： 【目的】最近，豚呼吸器複合感染症(PRDC)と呼ばれる，種々のウイルス及び細菌性病原体が複雑に関与した慢性呼吸器病の発生が問題となっている。今回，これによると思われる死亡事故が多発した農場において，ApワクチンとMhpワクチンを併用することにより顕著な効果が認められたので報告する。 【材料と方法】農場：PRRSV，PCV2，ApおよびMhpの感染が確認されている母豚1000頭規模の一貫経営農場。ワクチン：市販Ap不活化ワクチン(毒素型)及びMhp不活化ワクチンを用法・用量に従って注射。試験:ワクチン無接種，Apワクチン適用及びAp＋Mhpワクチン適用の各試験を実施。それぞれ7000～8000頭の子豚を対象に，約1年にわたる死亡事故率および一日増体重等を調査。 【結果】ワクチン無接種：死亡のピークは70～80日齢と130～150日齢にあり、出荷までの平均死亡率は約20％であった。死亡原因の大部分が胸膜肺炎で，病変からAp 2型菌が分離された。Mhpについては，肺にごく軽度の病変が存在した。 Apワクチン適用：70～80日齢時の死亡事故は減少し，平均死亡率は12%に低下した。けれども，肥育後期にある死亡のピークを抑制することはできなかった。Ap＋Mhpワクチン適用：両時期の死亡のピークは抑制され，平均死亡率は5%に低下した。無接種に比べ，一日増体重は38 g増加し，平均出荷日齢が4日短縮するなど，生産成績が大幅に向上した。 【考察】Mhpは気道粘膜上皮に存在する線毛運動を停止させ，種々の病原体の侵襲を容易にする。今回，Mhpワクチン注射により間接的にApの感染が抑制され，Apワクチンの効果が顕著に表れたと考えられる。
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IN VITRO CULTIVATION AND PARTIAL CHARACTERIZATION OF LAWSONIA INTRACELLULARIS FROM A JAPANESE FIELD CASE OF PORCINE PROLIFERATIVE ENTEROPATHY
Koyama,T., Hirai,T. and Nagai,S.
Nippon Institute for Biological Science
18th Congress of the International Pig Veterinary Society（IPVS 2004,Hamburg,Germany）
Abstract：Introduction and Objectives
Porcine proliferative enteropathy (PPE) is distributed throughout the world and affects mainly growing and finishing pigs with symptoms of unthriftiness, diarrhea, chronic weight loss, and death. PPE is characterized microscopically by an abnormal and marked proliferation of immature epithelial cells in the crypts and infection of these cells by a gram-negative, obligate intracellular bacterium, Lawsonia intracellularis (1). In vitro cultivation of L. ntracellularis is so difficult, due to the need for growing cells for propagation of the bacteria, that isolation and characterization of L. intracellularis has not been done in Japan.
Materials and Methods
Material for isolation of L. intracellularis was obtained from a pig that had bloody diarrhea and had typical macroscopic and microscopic lesions of PPE. The disease was confirmed by PCR specific for L. intracellularis (2). The intestinal mucosa was scraped off, trypsinized, filtrated through and then added to monolayers of IEC-18 (originated from rat small intestine) and HEp-2 (originated from human intestine) at 37℃ in an atmosphere of 5% O2 and 8.8% CO2 (3). The development of infection was monitored by specific PCR with supernatant of infected culture as template, and by immunostaining using rabbit serum specific for the bacteria. Oligonucleotide primers described by Cooper et al. (1997) and Jones et al. (1993) were used to amplify fragments of a 255-bp 16S-rDNA and a 270-bp species specific sequence, respectively. Primers for amplification of a 543-bp fragment of superoxide dismutase gene and a 656-bp fragment of 50-kDa outer membrane protein gene were designed from known sequences. These PCR products were cloned and sequenced.
Results and Discussion
In the infected monolayers, a lot of infected foci were observed by immunostaining. Some cells contained approximately fifty organisms in the cytoplasm (Figure 1). The supernatants of infected culture were positive by PCR throughout the experiment (approx. 1.5 month post inoculation). The number of the organisms was estimated to be more than 2x104 /ml by PCR. The nucleotide sequences of genes encoding 16S-rDNA, species specific sequence, superoxide dismutase and 50-kDa outer membrane protein of the isolate were 100, 99.6, 99.8, and 99.7%, respectively, identical to those of L. intracellularis type strain, NCTC12656T (Table 1). A high sequence similarity between the Japanese isolate and the type strain indicates a very close relationship of the two strains. No significant nucleotide sequence difference was also observed among L. intracellularis isolates so far reported (Czech republic : Tomanova et al., 2002, Slovac Carpathians: Tomanova et al., 2003, Swiss :Dittmer et al., 2003, Australia :Collins et al., 1996). Furthermore, no antigenic difference was detected among L. intracellularis isolates, suggesting a high genetic similarity among strains of this species.The present study describes the first in vitro cultivation and partial characterization of L. intracellularis from Japanese field case of PPE, which enables us to conduct a survey to estimate clinical significance of PPE in Asian swine industry.
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IGSラットのradiculoneuropathyの病変形成におけるSchwann細胞およびマクロファージの動態
中村圭吾、渋谷一元、菊佳男、平井卓哉、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第138回 日本獣医学会（2004年）
要旨：【背景および目的】ラットにおけるradiculoneuropathyは加齢に伴い脊髄神経根および末梢神経に発生が見られる病変であるが、その病理発生については不明な点が多い。近年、末梢神経系病変の病理発生においてSchwann細胞およびマクロファージ（MΦ）が重要な役割を担っていることが明らかになってきている。そこで今回我々は本疾患の病変形成とSchwann細胞ならびにMΦの動態との関連性を免疫組織化学的に検索した。【材料および方法】動物はCD(SD)IGSラットを用い、これらのラットの坐骨神経について形態学的に病変の程度を観察し、S100β蛋白、ED1およびCNPaseに対する抗体を用いて病変部の細胞動態を画像解析装置を用いて検索した。【結果】組織病変が認められなかった群（9,18、31週齢）ではS100β蛋白陽性のSchwann細胞の数に大きな変化はなかったが、加齢とともにCNPase陽性のSchwann細胞数は減少する傾向が見られた。MΦはほとんど検出されなかった。軽度病変が認められた群（57週齢）ではSchwann細胞数に大きな変化は見られなかったが、CNPase陽性細胞数の減少が見られ、MΦがしばしば検出された。重度病変が認められた群（109週齢）ではSchwann細胞数が著明に減少しており、CNPase陽性細胞はほとんど検出されなかった。一方、MΦの細胞数は顕著に増加していた。【考察】免疫組織化学的検索より加齢および病態の進行に伴う変化として、Schwann細胞の減数およびCNPase活性減少を指標とした機能低下、MΦの増数が示された。以上より本疾患の病変形性にはSchwann細胞および、MΦの動態が関与していることが示唆された。
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F1（AWE×WE）ウズラ胚を用いた性転換試験法によるノニルフェノール(NP)およびビスフェノールA(BPA)の評価
渋谷一元、水谷誠、佐藤一雄、板橋正文、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第138回 日本獣医学会（2004年）
要旨：環境ホルモンの鳥類における内分泌攪乱作用を検証できる簡便で有用なスクリーニング法として、演者らはF1（AWE×WE）ウズラ胚を用いた性転換試験法を新たに確立した。第136回本学会においてE2、EEおよびDESの投与用量と卵精巣の出現率および病変の程度がよく相関することを報告し、本試験法がエストロジェン様作用をもつ環境ホルモンのスクリーニングに有用であることを示した。今回は、ウズラのエストロジェンレセプターへの結合活性が示されているNPおよびBPAについて本法の有用性を検討した。【材料と方法】F1（AWE×WE）ウズラ卵の孵卵直前（孵卵0日）の卵白内にNPおよびBPAをそれぞれ200、2,000、20,000、200,000および2,000,000ng/20μLならびに20、200、2,000および20,000ng/20μL投与し、対照群には溶媒（コーン油）のみを20μL投与した。孵卵16日に胚を肉眼的に観察し、生殖器を病理組織学的に検索した。また、左側の全精巣面積に占める卵巣様組織の面積比率を画像解析システムを用いて計測した。【結果】対照群ならびにNPおよびBPA投与群では全ての生存胚の遺伝的性別（羽装）と孵卵16日の生殖器の性別が一致していた。全てのNPおよびBPA投与群の左側精巣における卵精巣出現率は対照群に比べて有意に高かったが、投与量との関連性はなかった。NPおよびBPA投与群の精巣における卵巣様組織の面積比率についても投与量との関連性はなかった。【考察】今回の結果から、本スクリーニング法がNPおよびBPAのエストロジェン様作用の検出に有用であることが示された（本研究は環境省の支援を受けた）。
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豚サーコウイルスの豚腎細胞における増殖性
平井卓哉、布谷鉄夫、伊原武志、渋谷一元、菊佳男、中村圭吾
日本生物科学研究所
第138回 日本獣医学会（2004年）
要旨：【背景と目的】豚サーコウイルス（PCV）には豚に対して非病原性のPCV1と離乳後全身性消耗症候群（PMWS）の主因になるPCV2がある。PCVは一般に豚腎由来株化細胞PK-15を用いて分離・培養されるが増殖性は低く、持続感染となる。我々は豚腎由来細胞におけるPCVの増殖を電顕的に調べた。【材料と方法】豚腎由来細胞SKにPMWS罹患豚の臓器乳剤を吸着させた後、グルコサミン処理を施し培養5日目に継代した。2代目以降はグルコサミン非処理で継代し、18代目に0～4日目の上清の感染価の測定ならびに細胞のウイルス抗原（IHC法）と遺伝子（ISH法）の検出を行なった。また3および4日目の細胞を採材し、電顕検索を行った。対照としてPCV1持続感染PK-15を4日目に採材し、電顕検索した。【結果とまとめ】4日目の上清中のPCV2の感染価は104.75TCID50/mlであった。抗原は核と細胞質で検出され、ISH法においてPCV遺伝子は同様の局在性を示した。電顕的に少数の細胞に細胞質封入体が観察された。これらは小型（0.25～0.90μm）で、直径14±1nmのウイルス粒子が渦巻き状あるいは結晶状に配列していた。一方、4日目のPCV1の上清中の感染価は104.50TCID50/mlであった。電顕的に少数の細胞に細胞質封入体が観察された。これらの大きさは0.18～2.86μmで、直径14±2nmのウイルス粒子が結晶状に配列していた。今回培養細胞においてPCV2のウイルス粒子を電顕的に初めて確認した。PCV1とPCV2の増殖形態は基本的には同様であった。封入体は電顕レベルで検出し得る小型のもので、PMWS罹患豚でみられる"botryoid inclusion"は認められなかった。
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実験動物として確立されたSPFニワトリLineM系とその維持管理システムについて
藤原哲、勝家康富、蔦木国博、五味誠治、新海久夫、小池雅春、唐澤茂、矢澤肇、水谷誠
日本生物科学研究所実験動物部
第５１回日本実験動物学会総会（2004年）
要旨：当研究所では1960年代よりニワトリの実験動物化の一環として、SPFニワトリに関する研究開発をおこない、SPFコロニーを確立し、生産・販売している。本コロニーは、1966年小松種鶏場より導入した白色レグホーン種を起源として、1969年、当所において確立したLine M系である。本系はこれまでニワトリの種々の疾病研究用、動物およびヒトの種々のワクチン製造用あるいは検定用動物として用いられている。標識遺伝子として特別に固定されているものはないが、3群のローテーションシステムで維持されている。また、Line Mより1975年に分離確立したクローズドコロニーWL-M/Oも維持している。本系は、白血病ウイルスgs(group specific)抗原が陰性、chf(chick helper factor)活性が陰性で、白血病ウイルスのサブグループ（A～E）のすべてに感受性（C/O）の系統である。この系統はC/ABの系統とともに発生学の研究にも使われている。その他の標識遺伝子としては、特別に固定されているものはない。これらのニワトリとともに、当研究所SPF鶏舎における維持管理システムについても紹介する。
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ニホンウズラにおける劣性黒色羽装を示すミュータントウズラについての遺伝子分析
藤原哲1)、水谷誠1)、小野珠乙2)、鏡味裕2)
1) 日本生物科学研究所実験動物部、2) 信州大学農学部
日本家禽学会秋季大会（2004年）
要旨：ニホンウズラの羽装の変異については現在までに、incomplete albino（"sw"性染色体、劣性）、yellow（"Y"常染色体、劣性、ホモ致死）、silver（"B"常染色体、優性）、brown（"e"性染色体、劣性）、cinnamon（"c"性染色体、劣性、incomplete albinoと複対立関係）、brown splashed white（"p"常染色体、劣性）、white（"c"常染色体、劣性）、buff（"pk"常染色体、劣性）、Extended brown（"D"常染色体、優性）などが報告されている。（財）日本生物科学研究所実験動物部においては1964年以来、ウズラの実験動物化についての研究が進められている。2003年、4月、当研究所において、野生型ウズラとは羽装の異なるミュータントが出現した。そこで、我々は、本ミュータントの羽装を調べるとともに、遺伝様式について研究を行なった。これらミュータントは、基本的に、黒色、茶色の2色で構成されており、特徴は次のようであった。出生時において、野生型では、黄色の羽装、背中に3本のほぼ同幅の黒色の縦縞が入るが、これらミュータントでは、全身黒色で背中に3本のほぼ同幅の濃い茶色もしくは不明瞭な縦縞の羽装を示した。成熟時において、野生型では胸の羽装による雄と雌の比較ができるが、本ミュータントウズラでは、雄、雌ともに胸の羽装、背側部、尾部においても同じ羽装を示すため区別することができない。遺伝子分析の結果、野生型との交配実験により常染色体劣性遺伝子により支配されていることが確認され、遺伝子記号を"rb" (recessive black)と命名した。今後、既に報告されている常染色体性の優性遺伝子に支配され、本ミュータントと同様な羽装を示すミュータントExtended brown系との交配実験を行なっていく予定である。
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INTRODUCTION OF GENES RELATING TO MUSCULAR DYSTROPHY INTO CHIMERIC CHICKENS BY EMBRYO ENGINEERING
Fujiwara,A.1), Mizutani,M.1), Ono,T.2), and Kagami,H.2)
1)Nippon Institute for Biological Science, Laboratory Animal Research Station,
2)Shinshu University
The 17th Annual and International Meeting of the Japanese Association for Animal Cell Technology (JAACT 2004).Industrial Application of Animal Cell Technology.
Abstract：A novel system has been developed to introduce genes relating to muscular dystrophy to chimeric chickens. Fertilized eggs were obtained from New Hampshire chicken; NH-413 strain which have genes relating to Fukuyama type muscular dystrophy. Blastoderms were isolated from these embryos. Cells from the center of area pellucida were specifically isolated from the blastoderms. Excess yolk were removed by PBS and only pluripotent cells were obtained. These cells were used as donor. Recipient embryos were obtained from White Leghorn chicken; Line-M. Approximately 700 cells were removed from the center of the area pellucida of the recipient in stage X blastoderm. The donor cells were microinjected into the subgerminal cavity of the recipients' blastoderms. The manipulated embryos were cultured ex vivo until hatching.The generated chimeric chickens had the donor derived brown plumage in the down, suggesting that the cells containing muscular dystrophy were introduced into the chimeras. These chimeric chickens will be raised until sexual maturity. The chimeric chickens will be back-crossed to donor strain; the New Hampshire. In case, these individuals would be germline chimeras, the New Hampshire's offspring would be breed very rapidly. These should be one of the powerful strategies for breeding and regeneration of chickens for an experimental animal model.
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牛プリオンタンパク質に対する新規抗体の作製と性状の解析
土屋耕太郎1)、山河芳夫2)、佐多徹太郎2)、小野寺節3)、上田進1)
1) 日本生物科学研究所、2) 感染研、3) 東大院・応用免疫
第５２回 日本ウイルス学会（2004年）
要旨：［目的］BSE検査等における異常型のプリオンタンパク質（PrP）の検出にはいくつかの抗体が使用されているが、非定型BSEの出現や若齢牛におけるBSEの発見、さらに肥飼料原料の安全性確保のための残存異常PrPの検出などに対応するためには、牛PrP特異抗体ライブラリーの充実を図る必要がある。そこで本研究では、牛PrP特異抗体を新規に作製し、その性状を解析したので報告する。［材料と方法］大腸菌発現牛PrP（rbPrP）あるいは合成ペプチドをプリオンレスマウスに免疫し、7個のモノクローナル抗体（mAb）を作製した。各抗体の牛正常PrPに対する反応性を、rbPrPおよびBSE非感染牛の脳乳剤を用いたELISAおよびウエスタンブロット法（WB）により検討した。また、牛異常PrPに対する反応性は、BSE感染牛の脳切片を用いた免疫組織化学染色および感染牛脳乳剤を用いたWBにより確認した。［結果と考察］mAbのアイソタイプは5個（2B11、2D8、4B5、6C4、6G3-2）がIgG1、2個（1D12、17F11）がIgG2aであった。正常牛PrPに対するELISAでの反応性は2D8以外で同程度に高かった。一方、WBでの反応性は17F11以外は同程度に高く、特に6G3-2はBSE感染牛（和歌山例あるいは神奈川例）の脳乳剤を用いたWBで数ug脳当量に含まれるプロテイナーゼK抵抗性PrPを検出できた。BSE感染牛の脳切片を用いた免疫組織化学染色では1D12＞2B11＞4B5＞6G3-2＞6C4の順に反応性が高かったが、2D8と17F11は力価が低かった。2個のmAb（2B11および17F11）を用いた牛PrP検出系（サンドイッチELISA）では、精製rbPrPを数pg/mLのレベルまで検出できた。現在、同検出系で牛異常PrPの検出を試みている。これらの成績より、本研究で作製した抗体は異常PrPの検出に貢献できると考えられた。
本研究の一部は「先端技術を活用した農林水産研究高度化事業」の一環として行なった。本研究にプリオンレスマウスを提供していただいた糸原重美先生（理化学研究所）に深謝いたします。
（非学会員共同研究者：日生研・細川朋子、佐藤一郎）
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