研究成果03

口頭発表

口頭発表2007年（平成19年）

１．

鳥インフルエンザワクチンの開発　 2. H7N7ウイルス不活化ワクチンの免疫効果

坂部沙織 1),2)、迫田義博1),2)、磯田典和1),2)、曽田公輔1),2)、萩原純子3)、林志鋒3)、
西條加須江4)、澤田章4) 、久米勝巳4)、喜田宏1),2),5)
1) 北大・獣医微生物
2) OIE高病原性鳥インフルエンザレファレンスラボラトリー
3) 日本生物科学研究所
4) 北里研究所
5) 北大・人獣共通感染症リサーチセンター
第 143回日本獣医学会、2007年
要旨：【目的】 H7亜型のインフルエンザウイルスは、H5ウイルスと同様にHPAIの原因となり得る。今回、緊急時に備えたH7亜型ワクチンを試製し、その免疫効果を調べた。 【方法】 第 140回本学会で、発育鶏卵培養で高い増殖性を示すH7N7亜型ウイルスA/duck/Hokkaido/Vac-2/04（ワクチン株）を樹立したことを報告した。本株で試製したオイルアジュバント不活化ワクチンを0.5mLずつ4週齢の鶏の下脚部筋肉内に1回注射し、経時的にHI抗体価を測定して抗体の持続を調べた。ワクチン注射後３週目にA/turkey/Italy/4580/99 (H7N1)（イタリア株）またはワクチン株とは抗原性が大きく異なるA/duck/Taiwan/Ya103/93 (H7N7)（台湾株）で攻撃し、14日間臨床観察し、あわせて臓器およびスワブからのウイルスの分離と血清中の抗NS1抗体の検出を試みた。また、ワクチンが効果を発揮するまでの期間を調べた。 【結果】 ワクチンを 1回注射した鶏の血中HI抗体価は、注射6週後にピークに達し、高い抗体価が6ヶ月間持続した。ワクチン注射3週後の鶏 [ 血中HI抗体価は32?2,048 (GM値357)]をイタリア株および台湾株で攻撃したところ、いずれの鶏も臨床症状を呈することなく14日間耐過したが、耐化鶏では多くの個体で抗NS1抗体が検出された。発症防御効果は、ワクチン注射8日後から認められた。 【考察】 本ワクチンは 1回の筋肉内注射で、注射8日後から発症を防御する効果があることがわかった。本ワクチンは感染防御能を付与できなかったが、ワクチン株とは抗原性が大きく異なる株で攻撃しても発症防御および環境中のウイルス濃度を低減させることができたことから、緊急用ワクチンとして有用と考えられた。

２．

国内飼養豚から分離された Actinobacillus pleuropneumoniae 血清型15の性状

小山智洋、To Ho 、長井伸也
日本生物科学研究所
第 143回日本獣医学会学術集会、2007年
要旨：【背景と目的】 Actinobacillus pleuropneumoniae (Ap) は豚胸膜肺炎の原因菌であり、また豚呼吸器複合感染症を引き起こす主要な因子のひとつである。 Ap は従来 14 の血清型（ 5 型のみ a, b の亜型）に分類されていたが、最近、オーストラリア由来株の解析から、新しい血清型 15 が提唱された (Blackall et al ., 2002) 。今回、国内で飼養されていた胸膜肺炎罹患豚から血清型 15 と見られる株が分離されたので報告する。 【材料・方法】 平成 15 年 10 月、一貫経営の養豚場において胸膜肺炎による死亡が多発したため、剖検および菌検索を行った。分離菌の同定は、グラム染色、 NAD 要求性および生化学性状検査により行った。さらに 16S rDNA の配列分析および PCR による Apx 遺伝子の検出を行い、これを確認した。血清型別は、 Ap1 ～ 12 型に対する特異抗血清に加え、今回新たに Ap15 参照株に対する抗血清を作製し、寒天ゲル内沈降反応により行った。病原性はマウス接種試験により調べた。 【結果】 本菌株は、各種試験により Ap と同定され、その血清型は 15 であった。本株は、 15 型参照株と同様に、 Apx II および III の２種類の細胞毒素遺伝子を保有した。本株のマウスに対する LD 50 は 7.7 Log CFU と計算され、 1 型および 5 型より弱く、 2 型と同程度の病原性を示した。 【考察】 今回分離された Ap は血清型 15 と同定されたことから、わが国においても本血清型菌が浸潤していることが明らかになった。現在 Ap 感染症対策には、各血清型間で共通抗原性の高い不活化毒素を主成分としたワクチンが使用されているが、 15 型に対しても交差防御が成立するのかどうか、今後の検討課題である。

3．

新奇な偏性細胞内寄生細菌 Lawsonia intracellularis の増殖性腸症罹患豚からの分離培養と部分的な性状解析

小山智洋、平井卓哉、長井伸也
日本生物科学研究所
第 80回日本細菌学会総会、2007年
要旨：【目的】 Lawsonia intracellularis は 1995 年に命名された偏性細胞内寄生細菌で、ブタ、ハムスター、モルモット、ウサギ、フェレット、イヌ、ウマ、シカ、サル、鳥類等の様々な動物に感染して腸炎を引き起こす。人への感染についても議論されているところである。本菌の人工培地での培養は、いまだ成功していない。今回、増殖性腸症罹患豚の国内発生例から初めて L. intracellularis を分離培養し、その性状の一部を基準株と比較した。 【方法】 急性の増殖性腸症に罹患した 160 日齢肥育豚より回腸を採材した。採材した腸の粘膜から乳剤を作製し、フィルターろ過およびパーコール密度勾配遠心法により集菌した。この菌体をラット小腸由来細胞株 (IEC-18) およびヒト上皮由来細胞株 (HEp-2) へ接種し、 37 ℃、 8.8% CO 2 -5.0 % O 2 下で培養を行った。菌の増殖は、 L. intracellularis に対するウサギ血清を用いた免疫組織染色により確認した。培養菌より抽出したゲノム DNA をテンプレートとして増幅した数種の PCR 産物について塩基配列を解析し、基準株の配列と比較した。 【結果と考察】 両培養細胞において、接種 5 日目にウサギ抗血清により特異的に染色される感染フォーカスが観察され、菌の増殖が確認できた。培養菌由来の数種の PCR 増幅断片の塩基配列は、基準株の配列とほぼ一致した。このことは本分離株が L. intracellularis であることを確認するとともに、わが国の分離株は、英国由来である基準株 (NCTC12656T) と近縁であることを示唆している。本菌は、欧米から輸入された原種豚を介してわが国に侵入した可能性が考えられた。
4．

A rational attenuated mutant of an avian pathogenic Escherichia coli serovar O78: a possible candidate live vaccine strain for the prevention of avian colibacillosis

Nagano, T., Kitahara, R. and Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
56 th Western Poultry Disease Conference, 2007
Abstract: 【 INTRODUCTION 】 Control of colibacillosis is important to the poultry industry because the economic impact of this disease is overwhelming. Escherichia coli serovars O1, O2 and O78 are frequently isolated from birds affected with collibacillosis. Pathogenic E. coli causes a variety of disease manifestations including septicemia, peritonitis, granuloma, and cellulitis in poultry. Traditionally, antibacterial agents have been widely used for the treatment and control of E. coli infection in poultry flocks. However, residual antibiotics in poultry meats and the emergence of drug-resistant bacteria have led to increasing interest in alternative methods of protecting poultry flocks against colibacillosis. Killed oil-emulsion vaccines for breeder hens and commercial broiler chickens have been licensed in Japan , but their use is limited because of the difficulty of application. To develop a live vaccine that is more efficient, safe and easy to apply, we constructed an attenuated mutant of avian pathogenic E. coli O78 by an allelic exchange procedure. In this presentation, we characterized the mutant having a deletion in the cyclic AMP receptor protein gene ( crp ) in immunological and safety aspects and we evaluated the mutant for potential use as a vaccine strain. 【 MATERIALS & METHODS 】 The parent bacterial strain used was the avian pathogenic E. coli strain J29 of serovar O78, which was originally isolated from a chicken with colisepticemia. Strain J29 showed comparatively low virulence for chickens and is sensitive to many kinds of antibiotics. Mutant AESN1331 was constructed from strain J29 using an allelic exchange system with a host E. coli strain SM10 lambda pir and a suicide plasmid pCVD442 containing a small crp fragment with a 351 bp deletion at a central part of the gene. The antigenicity, size and color of colonies grown on an agar plate, sugar fermentation, adsorption of congo-red, nucleotide sequence of the crp gene, LD 50 values in 5-week-old chickens, duration of the detection of the live bacteria in chicken organs after challenge by spraying, were examined using the mutant AESN1331 and parent J29 strains. In the first experiment, 40 of newly hatched white leghorn SPF Line-M chickens were randomly allocated to 3 groups of 10 each. Each group was inoculated twice at ages of 4 and 32 days by spraying with fine particles (group 1) or coarse particles (group 2) or by eye drops (group 3). The remaining 10 birds were used as untreated controls. To evaluate safety, all groups of chickens were monitored daily to detect adverse reactions subsequent to the administration, and were serially weighed at administration and challenge to confirm normal weight gain. For the evaluation of efficacy, all experimental and control chickens were intravenously challenged with virulent E. coli serovar O78 strain at the 46 days of age. After the challenge, chickens were monitored daily for signs of illness and for deaths. One week after the challenge, surviving chickens were euthanatized and macroscopic lesions were recorded. For serological examination, blood samples were taken from all chickens just before the administration and at the time of challenge to determine the serum antibody level using an O78 LPS ELISA. In the second experiment, 10 3 CFU of the mutant strain AESN1331 were inoculated into the amniotic fluid of eggs on the 19 th day of embryo development. To evaluate the efficacy of in ovo application of the mutant, the chickens hatched from eggs with or without administration, were intravenously challenged at the age of 32 days with virulent E. coli O78. The safety and efficacy of the administration was examined as described in the first experiment. 【 RESULTS 】 The crp mutant of E. coli AESN1331 was agglutinated with anti-O78 rabbit serum, indicating the LPS structure of the mutant was not affected by the introduction of the mutation. Within 16 to 24 h at 37 C, the mutant strain grew as a small colony on the trypticase soy agar plate and a colorless colony on the MacConkey agar plate. The mutant strain could ferment glucose, but could not ferment lactose or xylose. The parent strain J29 had the ability to adsorb congo-red, whereas the mutant AESN1331 could not. The nucleotide sequence analysis of the crp gene demonstrated that the parent strain J29 has a complete crp gene comprised of 633 bp, but the mutant AESN1331 possessed a small crp fragment of 282 bp, indicating that the central 351 bp of the gene had been deleted. LD 50 value of AESN1331 was approximately 10 times higher than that of the parent J29 (6.2 x 10 8 CFU vs 8.0 x 10 7 CFU). After inoculation via spraying, the mutant AESN1331 was detected in the chicken organs for only 3 days subsequent to the challenge, while the parent strain survived in the chicken body until day 35 after the challenge. In the first experiment, there were no adverse clinical signs or lack of weight gain in any birds after administration of the mutant AESN1331 twice. After the challenge exposure, 8 / 10chickens in the control group died, while only 1 / 10, 0 / 10 and 0 / 10 chickens died in the fine spray group, coarse spray group and eye drop group, respectively. The antibody levels measured after the last administration of the mutant strain (day 46) demonstrated that antibody response was detected in all treatment groups but not in the control group. Lesion scores for pericarditis and perihepatitis were significantly lower in the treatment groups compared to those in the control group. In the second experiment, all control chickens died after the challenge, in contrast all chickens treated with the mutant strain AESN1331 in ovo survived. Positive antibody response was found only in the treated group but not in the control group. Lesion scores for pericarditis and perihepatitis were significantly lower in the treated group than in the control group. 【 DISCUSSION 】 We constructed an attenuated mutant AESN1331 of the avian pathogenic E. coli serovar O78 using an allelic exchange procedure. The mutant strain showed a deletion in the crp gene, which is involved in the global regulatory network of gene expression in E. coli . It is well known that the crp gene plays an important role in utilization of a variety of carbon-containing substances, and the crp mutant could not ferment sugars other than glucose. Lately, the crp gene is also shown to be involved in the expression of virulence factors of E. coli including beta-hemolysin, which we described previously. The present data indicate that the mutant strain showed markedly reduced virulence and decreased colonization ability in the chicken body. However, administration of the mutant strain via various routes evoked an effective immune response that could protect against the virulent wild-type E. coli O78 strain. These findings suggest that the mutant constructed here appears to be a suitable candidate for a live vaccine strain to protect chickens from colibacillosis by avian E. coli O78.
5．

レトロウイルスインテグラーゼ遺伝子を利用したプラスミドのニワトリ胚への遺伝子導入

勝俣淳、星澄夫、岩田晃
日本生物科学研究所
第 99回日本繁殖生物学会大会、2007
要旨：【目的】 タンパクの大量発現系として家畜の利用が注目されているが、コストや BSEの問題からニワトリの利用が期待されている。しかし、放卵直後の胚ですでに発生が進んでいるため、マウス等で用いられているマイクロインジェクション法を利用するのは適当でない。一方、遺伝子導入に用いられるベクターとしてはレトロウイルスを用いた遺伝子導入法は、導入遺伝子が宿主細胞ゲノムへ挿入されるという利点を持つが、ベクター作製の煩雑さ、導入後の導入遺伝子の発現等に問題がある。そこで今回、 レトロウイルスの持つインテグラーゼが long terminal repeat (LTR) を持つプラスミドをゲノムに挿入 する 活性を有する事 に着目し、レトロウイルスインテグラーゼ遺伝子とその認識配列である LTRをもつプラスミドを培養細胞およびニワトリ胚へ導入を試みた。 【方法】 1. プラスミド ： サイトメガロウイルス（ CMV）プロモータによりEGFPを発現するプラスミド pEGFP-C1 に、インテグラーゼ発現ユニットを挿入した p422 を構築した。また、コントロールとしてインテグラーゼ遺伝子を欠く pΔ422 を構築した。培養細胞への遺伝子導入： HeLa 細胞へ FuGENE ６ を用いてトランスフェクション後、各 well に GFP 陽性細胞が 1 ? 8 個になるように 96 well plate へまき、 G418 で選択培養し、 G418 耐性細胞の出現数を調べた。ゲノムへの遺伝子の挿入は DNA を抽出し 、 PCR により調べた。 2. ニワトリ胚への遺伝子導入と導入遺伝子の解析：DNAは Transferrin/poly L-lysine と複合体を形成させ、レトロウイルスフリー白色レグホン （ C/O line M ） の受精卵の胚（孵卵直前）にガラスキャピラリーを用いて ( 20 μg/ml, 約 2μl/ 卵 )導入した。孵化したニワトリの翼下静脈から末梢血を採取し、そこから抽出した DNA を鋳型に、 EGFP 遺伝子内に作製したプライマーを用いて PCRを行った。 EGFP 遺伝子を保有していた G0 ニワトリの末梢血由来細胞を、 LPS( 20μg/ml) ＋ 5-azacytidine(3μM) 存在下で培養し、 EGFP の発現を確認した。 G0 ニワトリのうち 3羽を同系統のニワトリと交配し、第２世代 (G1) のニワトリを作製した。これらのニワトリについて同様に DNA を採取、 PCR を行い、 EGFP 遺伝子の保有状況を調べた。【結果・考察】 1. RSVインテグラーゼ遺伝子及びその認識配列であるLTRを持つプラスミドを HeLa 細胞へ導入したところ、コントロールプラスミドに対して約 4倍の効率で G418 耐性コロニーが現れた。そのうち少なくとも半数は LTR領域でプラスミドの切断が起こっていることから、ゲノムへの組込みにインテグラーゼの関与が考えられた。2, ニワトリ胚への導入については孵化したニワトリの約４割で、導入遺伝子がゲノムに保持されていることが確認された。インテグラーゼを欠くプラスミドでは組込みが確認できなかった。また、導入プラスミド由来配列の2代目（Ｇ１）への移行が確認された。3, 導入した GFP は LPS( 20μg/ml) ＋ 5-azacytidine(3μM) 存在下に、 in vitro で誘導可能であった。今回使用したベクターは、 DNA の状態でゲノムへの挿入が可能であった。ほかのウイルスベクターのようにベクター作製にパッケージングサイズやプロモーター等の制約を受けない。また、プロモーターを選ぶ事で、ニワトリ卵への目的遺伝子産物の大量発現が期待される。

6．

Experimental induction of amyloidosis in chicken

Hirai, T., Nunoya, T., Tomioka, H. and Nagano, T.
Nippon Institute for Biological Science
56 th Western Poultry Disease Conference, 2007 (Poster presentation)
Abstract: 【 INTRODUCTION 】 Amyloidosis is a group of diseases characterized by extracellular deposition of protein that contains non-branching, strait fibrils on electron microscopy that have a high content of s -pleated sheet conformation. In humans, at least 24 biochemically distinct proteins can transform into amyloid fibrils. In birds, spontaneous cases of amyloidosis are usually of the reactive or AA-type. AA amyloidosis is frequently associated with chronic inflammatory disease. The precursor of AA is acute phase serum amyloid A (SAA) protein and mainly originates in the liver. The concentration of SAA in the blood increases within 24 - 48 h after trauma, infection or inflammation. The synthesis and secretion of SAA is mediated by pro-inflammatory cytokines such as interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor- α . Rapin et al . described an outbreak of systemic amyloidosis with moderate to high mortality in two young layer flocks after repeated vaccinations with oil-emulsified bacterins. The amyloid deposits were present in the liver, spleen and kidney, and frequently accompanied by hepatic ruptures and hemorrhages. Amyloid arthropathy with systemic amyloidosis has been described as a clinical problem associated with growth depression and lameness in commercial brown layers. Massive accumulation of amyloid protein occurs in and affects the superficial articular cartilage, the nutritional vessels and the synovium. Landman et al . isolated Enterococcus faecalis from a case of joint amyloidosis. Induction of amyloidosis has been described in chickens using serial injections of living Staphyolococcus aureus cultures. Druet and Janigan used injections of sulfanile azocasein to produce amyloid in hens. Wang and Di reported liver amyloidosis can also be induced by repeated injections of Salmonella pullorum . In the present study, amyloidosis was investigated in chickens experimentally inoculated with mixtures of killed bacteria and adjuvant. 【 MATERIALS & METHODS 】 Twenty-six 28-day-old specific pathogen free chickens were used. The chickens were divided into a treated group ( n = 21) and a control group ( n = 5). They were fed ad libitum with a commercial diet. To induce amyloidosis, a high concentration of formalin-killed Salmonella enteritidis was suspended in phosphate buffered saline (PBS, pH 7.2) at a concentration of 4.8 × 10 10 cells/mL and emulsified with an equal volume of mineral oil adjuvant. At 28 days of age, the treated group received intramuscular injections in the left leg: 2.0 mL of the emulsions and 1.0 mL (corresponding to a double dose) of each of two commercially vaccines made by Nisseiken ( Ohme , Japan ). One was coryza vaccine (types A and C) in aluminium salt and the other was Mycoplasma gallisepticum vaccine in aluminium salt. These three inoculations were repeated three weeks later in the right breast and six weeks later in the left breast. Five of the 21 chickens died between 26 to 49 days after the first inoculation and the survivals were necropsied at 21 days after the third inoculation. Control chickens remained untreated through the experiment. The liver, spleen, kidney, heart, lung, thymus, bursa of fabricius , proventriculus and muscles were removed and fixed with 4% paraformaldehyde solution. All tissue samples were then embedded in paraffin, sectioned at 4 μm, and stained with hematoxylin and eosin (HE) and Congo red. Congo red-stained slides were viewed under polarized light for detection of the characteristic green birefringence of amyloid while other slides were examined under light microscopy. Formalin-fixed, paraffin-embedded tissues of livers and muscles were examined for the presence of chicken SAA or IL-6 mRNA by in situ hybridization (ISH). Heparinized blood of both groups was collected from the brachial vein once per week. Serum SAA concentration was determined by a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit (TP-802M; Tridelta, Maynooth Co. Kildare , Ireland ). 【 RESULTS 】 Clinical signs were noticed in all the chickens of the treated group. Chickens showed lameness in varied degrees from 1 to 18 days after the first inoculation. The mortality rate was 23.8 % (5/21) in the treated group. Gross lesions were mainly present in the liver and the muscles at the injection sites. The livers appeared firm, markedly enlarged, and the capsular surfaces were smooth. Hepatic parenchyma showed inconsistent discoloration with patchy green to yellowish-brown areas or sometimes red-brown areas. These findings were seen in 33 % (7/21) of the treated group. The injection site in all birds showed moderate to severe swellings, edema, and yellowish-white discoloration of skeletal muscles. The other visceral organs were not visibly affected. Microscopically, amyloid substances accumulated in Disse's space of the liver, in vascular walls of arterioles in the white pulp of the spleen, and in glomeruli of the kidney. These substances stained positively with Congo red. In Congo red-stained sections amyloid deposits showed apple green birefringence when viewed with polarized light. Ultrastructurally, the amyloid deposits consisted of components arranged in irregular arrays of parallel or crossed fibrils. Individual fibrils were of similar diameter (7 ? 10 nm) but varied in length. The incidence of amyloidosis was 66.7% (14/21). SAA mRNA was detected by ISH in the hepatocytes of severely affected chickens at high levels whereas sections pretreated with RNase were negative. The muscles at the injection sites had moderate to severe inflammatory changes with infiltration of macrophages, lymphocytes and rarely multinuclear giant cells. Various sized cysts containing amorphous eosinophilic and inflammatory debris were evident in the lesions. Lymphocytes, plasma cells and heterophils were scattered among the lesions and surrounding skeletal muscles. Fibroblasts with collagen were numerous in the outermost layers. IL-6 mRNA was detected by ISH in the macrophages in and around the lesions. Expression levels of IL-6 mRNA and serological SAA levels were higher in the severely affected chickens than in the controls. 【 DISCUSSION 】 In the present study, amyloidosis was demonstrated by Congo red stain and electron microscopy. In addition, expression of SAA mRNA in the hepatocytes and increased levels of serological SAA were confirmed in severely affected chickens. High expression of IL-6 mRNA in the injection sites may be related to an increase in the production of acute phase proteins in the liver of severely affected chickens. The results suggest that injecting mixtures of killed bacteria and adjuvant can induce AA amyloidosis in chickens.
7．

NS1-ELISAによる高病原性鳥インフルエンザウイルス感染の検出

竹山夏実1)、三成健二2)、土屋耕太郎1)、扇谷年昭3)、坂元隆一4)、西條加須江5)、今村孝4)、
坂口正士4)、林志鋒1)、迫田義博2) 、喜田宏2)
1) 日生研 , 2) 北大院獣医 ,3) 京都微研 ,4) 化血研 , 5) 北里研
第 55 回日本ウイルス学会学術集会、 2007 年
要旨：【背景・目的】 鳥インフルエンザ (AI) は、世界各国で流行している鶏の重要な感染症である。ここ数年間の国内発生を受け、 AI 国内ワクチンが開発された。ワクチンの使用に即して AI ウイルス (AIV) 感染鶏をワクチン注射鶏と識別する必要があり、我々は NS1 タンパク質に対する ELISA 抗体測定法を検討してきた。この NS1-ELISA によりワクチン注射鶏および AIV 接種鶏の NS1 抗体の産生および推移を調べた。 【材料・方法】 鶏血清中の NS1 抗体を、 Ck/Yamaguchi/7/04(H5N1) 株および Ck/Ibaraki/1/05(H5N2) 株の大腸菌発現 NS1 を用いた ELISA により調べた。 ELISA 抗体陽性血清については、特異性を Western blotting により確認した。試験には以下の３つの鶏群の血清を用いた。 (1) 高病原性 AIV(HPAIV) Ty/England/63(H7N3) 株あるいは低病原性 AIV(LPAIV) Ck/Ibaraki 株感染鶏、 (2) AI H7 ワクチン注射鶏、 (3) AI H7 ワクチン注射後、 HPAIV Ty/Italy/4580/99 (H7N1) 株あるいは Dk/Taiwan/Ya103/93 (H7N7) 株攻撃鶏。 【結果】 HPAIV である Ty/England 株感染では、耐過した全ての鶏で感染１週目より NS1 に対する明らかな抗体の上昇が認められた。抗体産生は少なくとも感染 8 週目まで持続し、 HI 抗体価の推移と相関した。一方、 LPAIV である Ck/Ibaraki 株感染鶏は臨床症状をほとんど示さず HI 抗体の産生も低く、 NS1 抗体の産生は認められなかった。 H7 ワクチン注射鶏では、注射後 40 週目まで NS1 抗体は検出されなかった。 H7 ワクチン注射後 3 週目にワクチン株と比較的 HA タンパク質の抗原性が近い Ty/Italy 株で攻撃した鶏では NS1 抗体の産生は認められなかったが、ワクチン注射後に HA の抗原性が離れている Dk/Taiwan 株で攻撃した鶏では、症状を示さずウイルス排泄も抑制されたが、 NS1 抗体の産生が認められた。 【考察】 本 NS1-ELISA は、 HPAIV に感染した鶏血清の NS1 抗体の検出に有用であった。一方で LPAIV 感染鶏は検出に十分な NS1 抗体を産生しないことが示唆された。本 ELISA により AI ワクチン注射後の非感染鶏と HPAIV 感染非発症鶏を識別できると考えられた。

8．

インフルエンザウイルスの非構造蛋白 NS1の抗原性解析

三成健二1),2)、迫田義博1),2)、竹山夏実3)、土屋耕太郎3)、林志鋒3)、喜田宏1),2),4)
1) 北大獣医微生物、2) OIE 高病原性鳥インフルエンザレファレンスラボラトリー、 3) 日生研、
4) 北大・人獣共通感染症リサーチセンター
第 55 回日本ウイルス学会学術集会 、 2007 年
要旨：【背景・目的】 鳥インフルエンザは養鶏業に対して大きな打撃を与える感染症である。ここ数年間の日本での発生を受け、緊急時に備えた不活化ワクチンが国内にて開発された。このワクチンの使用にあたり、ワクチン接種鶏と鳥インフルエンザウイルス感染鶏を識別するシステムが必要である。我々は、インフルエンザウイルスの非構造蛋白質 NS1 を抗原とした ELISA 法（ NS1-ELISA ）により、感染抗体のみを検出することを試みている。この NS1-ELISA の確立にあたり、 ELISA 抗原として用いる NS1 の遺伝子および抗原性の解析を行った。 【材料・方法】 インフルエンザウイルスの NS1 の分子系統解析を行った。解析に用いたインフルエンザウイルスの中から、国内で分離された A/chicken/Yamaguchi/7/04 (H5N1) （山口株）、 A/chicken/Ibaraki/1/05 (H5N2) （茨城株）を含む 5 株の精製 NS1 を大腸菌発現系にて作出した。また山口株、茨城株 NS1 のアミノ酸配列を元に 2 種の合成ペプチドを作成した。精製 NS1 および合成ペプチドをニワトリに免疫し、抗血清を作製した。高病原性株である A/turkey/England/63 (H7N3) （イングランド株）をニワトリに接種し、感染耐過した個体の血清を採取した。これらの血清と NS1 との反応性を ELISA および Western blotting にて調べた。 【結果】 アミノ酸配列の相同性より、 NS1 は大きく allele A, B の２つに分類された。 ELISA および Western blotting の結果、 allele A に属する NS1 の抗血清は allele A の NS1 と強く反応したが、 allele B の NS1 とは低い交差反応しか示さなかった。 allele A の NS1 を持つイングランド株の感染耐過血清も、同様に allele A の NS1 と強く反応したが、 allele B の NS1 との反応性は低かった。一方 allele B の NS1 の抗血清は、 allele A, B の NS1 に対して同程度の反応性を示した。 【考察】 NS1 は allele A, B 間において抗原性に差異があることが分かった。鳥インフルエンザウイルスの感染を抗 NS1 抗体の産生によって評価する為には、少なくとも allele A, B 両方の NS1 を抗原とする必要があると考えられた。

9．

ワクチンとその利用に関する技術的基盤

土屋耕太郎
日本生物科学研究所
第 4 回獣医内科学アカデミー（動物ワクチン研究会教育プログラム）、 2007 年
【要旨】 ワクチンは、もっとも有効な感染症への対抗手段であり、動物個体の疾病や経済的損失を減少させる。ワクチンは、人工的に動物個体の免疫系に働きかけ病原体に対する免疫記憶を獲得させることにより、感染防御能や発症防御能を賦与するものである。本講演では、ワクチンの技術的基盤として、免疫反応の概要とともに、不活化ワクチンと生ワクチンの比較およびそれぞれの長所および短所、混合ワクチンの利点とワクチン成分の干渉、ワクチン投与経路の特徴と注意点、免疫記憶を利用したブースター投与、エイジおよび移行抗体のワクチネーションに対する影響、並びにワクチン応答に影響を与えるその他の要因についてワクチネーションに影響する要因ごとに概説する。現実には複数の要因が複雑にワクチン効果の獲得に影響する。一概にこれらの要因による影響への対処法を示すことは難しいが、ワクチンの選択と投与スケジュールを検討し見直す上での一助になれば幸いである。

10．

豚丹毒生ワクチンの安全性の再評価

天野健一1)、本田隆2)、小川哲夫3)、瀧川義康4)、山崎康人5)、染野修一6)、大石英司7)
1) 松研 、2) 化血研、3) 科飼研、4) 北研、5) 共立製薬、6) 日生研、7) 京都微研
第 143 回日本獣医学会学術集会、 2007 年
要旨：【背景・目的】 近年、野外発病例や食肉検査所の分離株の中に豚丹毒生 ワクチン (LV) 株と類似の性状を呈する株の存在が報告され、本ワクチンの安全性を再評価することが求められた。そこで、豚を用いた LV 接種試験、野外における LV の使用状況と食肉検査所での豚丹毒の発生状況調査を LV の製造販売を行なっている 7 所社で協同して実施した。 【材料・方法】 接種試験には計 7 施設で 10 ～ 16 週齢の SPF 豚又はコンベンショナル豚計 74 頭を用いた。それぞれ、 LV 接種群 8 ～ 10 頭と対照群 1 ～ 3 頭とを出荷時まで同居飼育した。接種後経時的に臨床観察を行い、出荷時には剖検を行なうと共に肘・膝関節を含む主要臓器から豚丹毒 (SE) 菌の分離・同定を試みた。接種時、接種後 3 週目及び剖検時に生菌凝集抗体価を測定した。 LV ワクチンの使用状況に関して、 2005 年 1 月から約 1 年間の LV 使用農場及び非使用農場の出荷頭数と SE による廃棄頭数とを調査した。 【結果・考察】 LV 接種後、ほとんどの豚で善感反応が観察されたが、臨床観察で異常を呈した豚は認められず、抗体応答は概ね良好であった。剖検所見では極く一部の豚で軽度な変化が認められたが、各臓器からの SE 菌分離は全ての豚が陰性であった。対照豚への同居感染は認められなかった。 LV 使用農場及び非使用農場の出荷頭数はそれぞれ 1,018,420 頭 (LV 年間使用頭数の約 10.7%) 及び 40,019 頭であり、うち SE による廃棄頭数はそれぞれ 73 頭 (0.007%) 及び 16 頭 (0.04%) であったことから、 LV 接種で SE による廃棄率は著明に減少することが判明した。以上の成績から、豚丹毒生ワクチンの安全性が再確認された。

11．

ANTIGENIC AND GENETIC DIVERSITY OF THE SURFACE PROTECTIVE ANTIGEN (SPA) OF ERYSIPELOTHRIX RHUSIOPATHIAE

To Ho, Someno, S. and Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
The 3 th Congress of the Asian Pig Veterinary Society, 2007 at Wuhan , China
Abstract: 【 Introduction 】 Erysipelothrix rhusiopathiae surface protective antigen (Spa) has been shown to be highly immunogenic and is a potential candidate for a new vaccine against erysipelas. The spa gene from E. rhusiopathiae serovars 1 and 2 was cloned and sequenced; however, the spa of other serovars has not yet been characterized. In this study, we classified Spa into three molecular species by comparing their deduced amino acid sequences from 17 reference serovars of E. rhusiopathiae , and examined their antigenic variations. 【 Materials and Methods 】 PCR and all other DNA manipulations were performed with standard molecular biological techniques. To evaluate the cross-protection induced by immunization with rSpas, mice were immunized s.c. with 40 μg of purified rSpaA, rSpaB or rSpaC twice, then challenged s.c. with homologous and heterologous serovar strains after two weeks. Mortality was monitored over the subsequent two weeks. 【 Results 】 Phylogenetic analysis of the deduced amino acid sequences of Spa from 17 serovar strains demonstrated that there are three molecular species of Spa, designated SpaA, SpaB, and SpaC. E. rhusiopathiae serovars 1a, 1b, 2, 5, 8, 9, 12, 15, 16, 17, and N produced SpaA, serovars 4, 6, 11, 19 and 21 produced SpaB and a serovar 18 produced SpaC. The amino acid sequence similarities within each Spa from different serovars ranged from 96 to 99%, in contrast similarities between different Spas ranged from 61~64% between SpaA and SpaB, 63~65% between SpaA and SpaC and 66~67% between SpaB and SpaC. Rabbit antisera specific to each Spa strong ly reacted to homologous Spa protein, but weak ly reacted to heterologous Spa proteins shown by the immunoblot assay . Cross-protection study showed that the three rSpas elicited complete protection against challenge using homologous strains, but levels of protection against challenge using heterologous strains varied depending on the rSpa protein used for immunization. 【 Discussion 】 The present study is the first to describe the antigenic and sequence diversity in the Spas of E. rhusiopathiae , which could be classified into three molecular species. The N-terminal hal f of the Spa protein is suggest ed to play a major role in immuno- protection. In this study, we found a high sequence diversity in this region among three Spa proteins, suggesting that it may lead to a difference in epitope structure of the N terminal half of each Spa protein, which may be the basis of the differences in antigenicity and levels of cross-protectivity. In addition, SpaC seems to be the most promising protective antigen for use as a vaccine component, because of its broad cross-protectivity.

12．

抗犬 IgE特異的モノクローナル抗体の作出および性状解析

金芝璟、細川朋子、佐合健、佐藤一郎、土屋耕太郎
日本生物科学研究所
第 143 回日本獣医学会学術集会、 2007 年
要旨：【背景・目的】 近年、人のアレルギー疾患の患者数が増加するとともに犬のアレルギー症も増加傾向にあり、特に、アトピー性皮膚炎は高い発生率を示していると言われている。犬のアレルギーの代表的な症状である｢痒み｣は皮膚や耳に関連する他の原因による皮膚病と識別をする必要がある。アレルゲンを特定するための最も有効な手段は皮内テストであるが、血清中のアレルゲン特異的 IgE の検出も有用な情報となる。そこで、本研究では、 IgE を特異的に検出するためのモノクローナル抗体 (mAb) を作出し、性状解析を行った。 【材料・方法】 犬 IgE-C3 および C4 ドメイン部分を大腸菌で発現させたもの（ rdIgE ）あるいは精製犬 IgE で免疫したマウスの脾臓細胞を用いて抗犬 IgE 抗体分泌ハイブリドーマを作製した。得られたモノクローナル抗体（ mAb ）についてアイソタイプを同定し、犬 IgE に対する特異性および検出感度を ELISA で調べた。 【結果・考察】 rdIgE あるいは精製犬 IgE を用いてスクリーニングを行い、得られた mAb はアイソタイプ IgG1 が 1 種類、 IgG2a が 8 種類、 IgG2b が 2 種類、 IgM が 8 種類、 IgA が 1 種類の計 20 種類であった。そのうち、 IgE との反応性が比較的高く、かつアイソタイプが IgG のもの 10 種類を選択し、以降の性状解析に用いた。各 mAb は、犬 IgE とは高感度に反応し（約 80pg ）、犬 IgG および IgM に対する交叉性はほとんどなかった。従って、これらの mAb は、血清中の IgE の定量やアレルゲン特異的 IgE の検出などに有用であると考える。現在、これらの mAb の認識部位について知見を得るため、解析を進めている。
13．

猫 MHC クラス Ⅰ (FLA-A, -B) 遺伝子のクローニングとタイピング

佐野順一、藤原哲、島津美樹、齋藤敏樹
日本生物科学研究所　
第 144 回日本獣医学会学術集会、 2007 年
要旨：【背景・目的】 HLA(Human Leukocyte Antigen) は高度な遺伝子多型性を有し、ヒト免疫機構に重要な役割を果たしており、 HLA の遺伝子多型の検索は骨髄移植・臓器移植の適合性の確認や疾患感受性の研究に欠かすことのできないものとなっている。猫における MHC は FLA と呼ばれるが、まだ十分な検索が行われておらず、特にクラス Ⅰの報告は少ない。そこで、従来報告の少ない FLA クラス Ⅰ遺伝子 (FLA-A, -B) の塩基配列および多型を明らかにし、臓器移植や疾患感受性の研究に役立てることを目的とした。 【材料・方法】 当研究所にて確立した猫のうち、 10 頭の末梢血より単核細胞を採取し、 mRNA を抽出後、 cDNA を合成し、ヒトおよび猫 MHC の塩基配列を参考にして設計したプライマーを用いてクローニングを行い、その塩基配列を解析した。 【結果・考察】 FLA-A 遺伝子に関しては 11 個、 FLA-B 遺伝子に関しては 3 個の多型を検出した。 FLA-A, -B 遺伝子ともに 362 個のアミノ酸をコードし、その構造は塩基配列から Leader 領域、 α1-domain 領域、 α2-domain 領域、 α3-domain 領域、膜結合領域、細胞内領域に分類された。塩基配列を解析した結果、遺伝子多型は FLA-A, -B 遺伝子ともに各領域に渡り広く存在することが判明した。我々が得たクローンは Yuhki らが報告したクローンとは異なっており、猫の品種や地域により異なった多型が存在することが示唆された。

14．

ニホンウズラ主要組織適合性抗原複合体 Mhc(Coja)領域におけるハプロタイプ解析

鈴木進悟1)、細道一善2)、椎名隆2)、水谷誠3)、藤原哲4)、原ひろみ1)、吉田豊1)、半澤惠1)
1) 東京農大農学部、2) 東海大学医学部、3) 名古屋大学農学部、4) 日生研
日本 DNA 多型学会第 16 回学術集会、 2007 年
要旨：【背景・目的】 本研究室ではニホンウズラにおいてニワトリ Mhc-B 領域（ 92kb ）との相同領域 Mhc-Coja 領域（ 180kb ：ハプロタイプ 1 （ HT1 ）を同定し、さらに主働 Mhc クラス IIB ： DBB1 遺伝子座を含む Tapasin-BRD2 遺伝子座間（ 4 ? 11kb ）について詳細に解析し 4 つのハプロタイプ： HT2 ? 5 の塩基配列を決定している。本実験では、 10 系統 290 個体のウズラを対象に Coja 領域をカバーするように設計した 8 種の多型マーカーにより Coja ハプロタイプを精査した。 【材料・方法】 本大学所有の 7 系統： A 系 27 個体、 B 系 31 個体、 ND 系 75 個体、 K 系 14 個体、 P 系 15 個体、 Y 系 16 個体および RR 系 20 個体、ならびに日本生物科学研究所所有の 3 系統： AMRP 系 32 個体、 PNN 系 30 個体および SBPN 系 30 個体のゲノム DNA を供試した。 8 種類の多型マーカー：セントロメア側より順に HEP21 、 DCB1 、 DBB1 、 DMB2 、 DMB2-DMB1 間、 TAP2 、 CD1.2 および CD1.1 を SBT あるいは RFLP によりタイピングし、得られた結果からハプロタイプ推定プログラム PHASE を用いて解析した。 【結果・考察】 8 種類の多型マーカーの対立遺伝子数はそれぞれ 8 、 7 、 7 、 3 、 2 、 6 、 4 および 5 であった。 PHASE により 27 種類のハプロタイプ（ HT1 ? 27 ）の存在が推定された。このうち 8 つのハプロタイプは系統特異的であり、特に AMRP 系は特異的なハプロタイプ： HT27 に固定されていた。また HEP21-DCB1 間（推定 150kp ）の連鎖は弱く、逆に DCB1-DBB1 間（ 5kb ）は完全連鎖であった。一方、ニワトリでは報告のない、 Mhc クラス IIB とクラス I との間の組み換えを示唆する DBB1-DMB2 間（ 24kb ）の組み合わせに由来するハプロタイプが推定され、さらに CD1.2-CD1.1 間（ 1.2kb ）の組み換えが示唆された。

15．

Comparative Aspects of Spontaneously Occurring and Chemically Induced Brain Tumors in Rats

Shibuya, K.
Nippon Institute for Biological Science
2007 Annual Meeting of the Korean Society of Toxicologic Pathology, Soul , Korea (Oral Presentation)
Abstract: Long-term toxicity studies, such as 2-year carcinogenicity studies, in rats have contributed the evaluation of carcinogenic risk of various environmental chemicals and drugs. For assessing risk of carcinogenicity, a great deal of information concerning spontaneous tumors in rats is required to differentiate chemically induced tumors from spontaneous ones. Spontaneously occurring brain tumors in rats are very rare compared with tumors in some other organs. Therefore, accumulating the historical reference data on the incidence, biological and morphological characteristics of the spontaneous brain tumors is very important for assessing safety evaluation of chemicals in the central nervous system (CNS) in rats. On the other hands, useful models of chemically induced brain tumors, using N-nitroso compounds, in rats have been developed. These models provide many advantages to assess the promoting effects of various chemicals. Then, it is meaningful to compare many aspects of spontaneously occurring and ethylnitrosourea (ENU)-induced brain tumors in rats. 【 Spontaneously occurring brain tumors in rats】 Many reports on spontaneous brain tumors in rats have been published. To date, various type of spontaneous brain tumors, such as astrocytoma, oligodendroglioma, mixed glioma, ependymoma, choroid plexus tumors, medulloblastoma, ganglioma, ganglioneuroma, meningioma, granular cell tumor, malignant reticulosis and others, have been reported in rats. In the historical reference data of our institute, spontaneous brain tumors have been rarely observed in F344 rats and most of the tumors were detected in aged rats. In our institute, types of spontaneous brain tumors were limited, including astrocytoma, oligodendroglioma, meningioma, granular cell tumor in the meninges, medulloblastoma, and malignant reticulosis. The incidence of spontaneous brain tumors in male rats was higher than that in female rats. Morphological and immunohistochemical characteristics of spontaneous tumors were investigated . 【 ENU-induced brain tumors in rats 】 The brain tumors were induced in the offspring by a single intravenous injection of 0, 1.25, 2.5, 5, and 10 mg/kg/BW of ENU in F344 rats on day 20 of gestation. Types of ENU-induced brain tumors were very limited in F344 rats. Astrocytoma, oligodendroglioma and mixed glioma were major tumors in the brain and schwannoma was detected in the trigeminal nerves and nerve roots of the spinal cords. In addition, preneoplastic lesions, such as atypical hyperplasia of astrocytes or oligodendrocytes were observed in the brain. The incidence of ENU-induced brain tumors were correlated with dose of ENU. The incidences of brain tumors in 32-week-old rats were higher than 20-week-old rats, whereas the incidence of hyperplastic lesions in the brain were similar between 20-week-old rats ad 32-week-old rats. The incidence of ENU-induced brain tumors in male rats was similar to that in female rats. Morphological and immunohistochemical characteristics of ENU-induced tumors and hyperplastic lesions were investigated.

16．

ブタの脊髄

平井卓也
日本生物科学研究所
第 47 回獣医病理学研修会、 2007 年
要旨：【動物】 ブタ、 LWD 種、雄， 35 日齢 。 【 臨床事項 】 繁殖母豚 450 頭飼養規模の一貫経営農場で 、 2006 年 8 月頃から離乳舎で 1 豚房に 1 ～ 2 頭、神経症状を呈し斃死する個体が散見された。神経症状は前肢または後肢の伸張で，強直性痙攣もみられ、病豚は発症後 2 ～ 3 日で斃死した。提出例はそのうちの 1 頭である。抗生剤を投与したが効果はみられなかった。 【肉眼所見】 大脳および小脳の髄膜が充血していた他、諸臓器に異常はみられなかった。 【参考所見】 大脳および三叉神経からのウイルス分離は陰性であった。 【組織所見】 脊髄灰白質の腹角には腫大・円形化した運動神経細胞が散在していた。変性・壊死に陥った神経細胞の周囲には小膠細胞や炎症性細胞が取り囲む神経食現象（図 1 ）、グリア結節（図 2 ）などがみられた。灰白質および白質にはリンパ球、形質細胞ならびにマクロファージからなる囲管性細胞浸潤や腫大した軸索が認められた。上記の所見は脊髄灰白質、特に腹角で強い傾向を示した。神経根にはリンパ球とマクロファージが浸潤し（図 3 ）、髄鞘崩壊による髄球形成を伴っていた（図 4 ， LFB ） 。脊髄神経節では一部の神経節細胞は変性して好酸性を増し、神経節細胞周囲にはリンパ球、形質細胞ならびにマクロファージが浸潤していた。豚エンテロウイルス （ PEV ） 性脳脊髄炎を疑い、脊髄および脊髄神経節についてマウス抗豚テシオウイルス （ PTV ） モノクローナル抗体を用いた免疫組織化学的染色（動物衛生研究所の好意による）を行ったところ、神経細胞、グリア結節内のグリア細胞、神経節細胞に陽性所見（図 5 ， IHC ）が得られた。 【診断】 PTV/PEV の関与が疑われた非化膿性脳脊髄炎、神経根炎ならびに神経節炎。 【考察】 豚エンテロウイルス性脳脊髄炎の原因ウイルスである PEV は 13 の血清型に分類されていたが、近年の遺伝子学的解析により PTV および PEV に再分類された。 PTV/PEV は健康な豚の腸内容物・糞便・扁桃などから高率に分離され、多くの豚に不顕性感染していると考えられている。豚エンテロウイルス性脳脊髄炎の主要な神経症状は運動失調や四肢の麻痺などで、組織学的に非化膿性脳脊髄炎が主に脳幹部、小脳ならびに脊髄に出現し、灰白質は白質に比較して強く障害されることが特徴である。 OIE の診断マニュアルによれば、本病の確定診断には神経症状が認められること、非化膿性脳脊髄炎が観察されること、脳脊髄からウイルスが分離されることが必要とされている。本例は豚エンテロウイルス性脳脊髄炎と病理診断されるが、ウイルスが分離されていないため確定診断には至らなかった。我が国における本病の報告は少なく、病理発生については不明な点が多いため、今後さらに症例を集め検討する必要があると考えられた。

ページTOPへ