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Mutations in the spike gene of porcine epidemic diarrhea virus during serial passages in Vero cell culture.
Sato, T., Takeyama, N., Katsumata, A., Tuchiya, K. and Kusanagi, K.
Nippon Institute for Biological Science
The 4th Congress of Asian Pig Veterinary Society, 2009 (Tsukuba, Japan)
ABSTRACT:【Introduction】Porcine epidemic diarrhea (PED) virus (PEDV), a member of the family Coronaviridae, is an enveloped and single-stranded RNA virus. It causes severe diarrhea in pigs, especially in newborn piglets. The spike (S) protein of PEDV is proposed to be an important site of virus neutralization and receptor binding. In addition, it has been shown that the S protein of various coronaviruses plays an important role in determining the virus pathogenicity. PEDV has been shown to reduce its pathogenicity in piglets through serial passage in Vero cell cultures. The 100th serial passage level of the parental 83P-5 strain is licensed in Japan as the live-attenuated vaccine strain P-5V. However, the molecular determinants responsible for the attenuation of PEDV during serial passages are not well understood. In this study, we investigated mutations in the S gene of 83P-5 associated with the virus attenuation during serial passages in Vero cells to better understand the mechanisms underlying the virus attenuation.【Materials and Methods】The parent 83P-5 strain isolated from pigs with diarrhea was used at the second cell passage for propagation. Viral RNA was extracted from Vero cells infected with the parent, intermediate (34th-passage and 61st-passage levels), and attenuated (100th-passage level) PEDV 83P-5 strains. Reverse transcription-polymerase chain reaction primers for amplification of the full-length S gene were designed based on published sequences of the PEDV gene. The amplified full-length S gene was cloned, sequenced, and analyzed.【Results】The S genes of the parent and intermediate strains consisted of 4152 nucleotides encoding 1383 amino acids, whereas the attenuated strain had in-frame 3 nucleotides deletion in this region. Compared to the parent strain, there were 6, 10 and 18 nucleotide changes in the 34th-passage, 61st-passage and attenuated strains, respectively. These mutations were predicted to change 5, 9 and 13 amino acids in the 34th-passage, 61st-passage and attenuated strains, respectively. The high nonsynonymous nucleotide changes strongly suggested that the mutations were positively selected during the serial passage. All of the amino acid changes, except one, present in the 34th-passage and 61st-passage strains or also found in the attenuated strain indicating a sequential accumulation of the selected mutation through the attenuation. We also compared the S gene of attenuated 83P-5 strain with that of another live-attenuated DR13 strain reported elsewhere. Interestingly, the attenuated 83P-5 and DR13 strains shared a total of 10 common amino acid changes in respect to their parent strains, and 8 of them were identified as mutations that were sequentially accumulated during the virus attenuation in our study. 【Discussion and conclusion】The date present herein document the positive selection and serial accumulation of mutations in the S gene of PEDV through virus attenuation in vitro. The 10 amino acid changes that were observed commonly in the attenuated 83P-5 and DR13 strains might be one of the causalities of the attenuation of PEDV. It remains to be determined whether the mutations associated with the virus attenuation in fact influence the functions of the S protein of PEDV, i.e., virus neutralization, receptor binding and/or pathogenicity. |
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Prevalence of swine Torque teno virus genogroups 1 and 2 in Japanese swine with suspected post-weaning multisystemic wasting syndrome and porcine respiratory disease complex.
Taira, O., Ogawa, H., Nagao, A., Tuchiya, K., Nunoya, T. and Ueda, S.
Nippon Institute for Biological Science
The 4th Congress of Asian Pig Veterinary Society, 2009 (Tsukuba, Japan)
ABSTRACT: Torque teno virus (TTV) was first isolated from a human hepatitis patient in 1997. TTV was also identified in several animals, including pigs, cattle, sheep, cats and dogs. In this study, we analysed the prevalence of swine TTV genogroups 1 (TTV1) and 2 (TTV2) in Japanese swine populations with suspected post-weaning multisystemic wasting syndrome and porcine respiratory disease by using a nested polymerase chain reaction method. Of 153 serum samples from 16 different herds in Japan, TTV1 was detected in 46 samples (30%), TTV2 in 47 samples (31%) and both in 15 samples (10%). There was no significant difference in the detection rate among geographical regions. The overall prevalence rate of TTV genogroups was significantly lower in < or = 30-day-old pigs (11%) compared to that in older age groups (54-82%). These results suggest that swine TTV may be widespread in post-weaning pigs and could play aetiological roles in pig diseases in Japan. This is the first report on the prevalence of swine TTV in Japan.
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| ３． |
Multiplex PCR and multiplex RT-PCR for inclusive detection of major swine DNA and RNA viruses in pigs with multiple infections.
Ogawa, H., Taira, O., Hirai, T., Takeuchi, H., Nagao, A., Ishikawa, Y., Tuchiya, K.,
Nunoya, T. and Ueda, S.
Nippon Institute for Biological Science
The 4th Congress of Asian Pig Veterinary Society, 2009 (Tsukuba, Japan)
ABSTRACT: Multiplex PCR and multiplex RT-PCR were developed to identify nine viruses in pigs with multiple infections. These viruses are: porcine circovirus type 2 (PCV2), suid herpesvirus 1, porcine parvovirus (PPV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), Japanese encephalitis virus, porcine rotavirus A (PoRV-A), porcine epidemic diarrhea virus (PEDV), transmissible gastroenteritis virus (TGEV), and Getah virus. These methods were shown to be high specificity and sensitivity. In the clinical application, a total of 75 field samples were examined by our methods and previously reported methods for PCV2, PRRSV, TGEV, and PEDV. As a result, the detection rates of our multiplex PCR and multiplex RT-PCR were higher than those of the previously reported methods. Furthermore, it was confirmed that 24 PCV2 positive samples were co-infected with other viruses, 11 with PRRSV, 10 with PPV, 2 with PoRV-A, and 1 with TGEV by a combination of multiplex PCR and multiplex RT-PCR. PPV and PoRV-A were newly detected by multiplex PCR and multiplex RT-PCR. These results suggest that the combination of our multiplex PCR and multiplex RT-PCR is useful for rapid and accurate identification of nine major pathogenic viruses in pigs with multiple infections.
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| ４． |
Identification and characterization of Actinobacillus pleuropneumoniae isolate serobar 15.
To Ho, Koyama, T., Sato, H., Nagano, T., Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
The 4th Congress of Asian Pig Veterinary Society, 2009 (Tsukuba, Japan)
ABSTRACT:【Introduction】Actinobacillus pleuropneumoniae (A. pleuropneumoniae) is the etiological agent of porcine pleuropneumonia, a respiratory disease that causes economic losses worldwide. Very recently, a new serovar, serovar 15, has been recognized in Australia and Japan. Current vaccines did not provide cross-protection against the serovar 15 challenge. In this study, we present identification and characterization of A. pleuropneumoniae isolates serovar 15 from different geographical sources.【Materials and Methods】Serological typing of A. pleuropneumoniae was determined based on the results of serological characterization and the toxin gene profiles. PCR and all other DNA manipulations were performed with standard molecular biological techniques. Genotypic variation within the isolates of serovar 15 was obtained by pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) with the bacterial DNA digested with the restriction enzyme SpeI. The apxIIA and apxIIIA genes were cloned into pGEM-T Easy, sequenced and analyzed. Lipopolysaccharides (LPSs) was extracted using the lysozyme-phenol-water method. Antigenic characteristics of polypeptides and LPSs were screened by SDS-PAGE coupled with immunoblotting.【Results】Two and four A. pleuropneumoniae isolates from Japan and Argentina, respectively, showed a clear reaction to antiserum raised against a reference strain of serovar 15, HS-143. The six isolates were found to contain genes for the expression and activation of ApxII and ApxIII (apxIICA, apxIIICA, respectively), and gene for expression of ApxIV (apxIVA). In addition, these isolates also contained the genes associated with the secretion of ApxIII (apxIIIBD) and ApxI (apxIBD) but not the genes for the expression and activation of ApxI (apxICA).Among 7 isolates serovar 15 that were analyzed by PFGE, 2 different pulsed-field (PF) types were detected. Similarity analysis of the ApxIIA and ApxIIIA sequences of 7 isolates using the BLAST programms revealed homology ranging from 99.8 to 100 % with those of strain HS143. The SDS-PAGE and immunobot profiles of polypeptides of the isolates were rather similar, but some small differences were seen in molecular masses ranging from 60 to 100 kDa, and below 30 kDa. Similarily, the SDS-PAGE and immunobot profiles of LPS were strikingly similar, and chacteristics of a typical type LPS with repetitive O-chains of A. pleuropneumoniae serovar 15. 【Discussion】The A. pleuropneumoniae isolates were identified as serovar 15 based on analysis by serological typing, toxin gene profile, and the phenotypic toxin expression profile. The genotypic relationship, immunogenic proteins and LPSs of A. pleuropneumoniae isolates serovar 15 were found to be rather similar. The carboxy-terminal sequence of ApxIII toxin protein and antigenic characteristics of capsular polysaccharide (CPS) and LPS, other important virulent factors, of A.pleuropneumoniae serovar 15 were found to be different from those of serovars used in the current vaccine preparations.The results of the current study help explain why the current vaccines failed to provide a protection against challenge with serovar 15, and also suggest that CPS and LPS could be used as diagnostic tools to monitor the infection and as immunogens for inclusion in vaccine preparations for animal protection.
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鶏大腸菌血清型O78菌株由来サイクリックAMPリセプタータンパク質（CRP）遺伝子欠損変異株の作出. 1. 作出過程及び変異株の細菌学的性状.
長井伸也、永野哲司、鳥海宏司、北原梨恵
日本生物科学研究所
第146回日本獣医学会学術集会、2008
要旨：【背景及び目的】我々は前にトランスポゾンのランダム挿入変異株の解析から、CRP遺伝子が鶏大腸菌の病原因子の発現制御に関与していることを報告した（Vet Microbiol, 1998）。そこで、鶏に対する強毒株で多くみられる血清型O78の菌株（J29）を選択し、これより相同組換えによりCRP遺伝子欠損変異株を作出した。【材料及び方法】プラスミドにクローン化したJ29のCRP遺伝子から、オープンリーディングフレーム内351bpの領域を常法により欠損させた（⊿crp）。これを遺伝子置き換え用のプラスミドベクターであるpCVD442にクローン化し、大腸菌SM10λpir株に形質転換してJ29に接合伝達させた。この株を5%の蔗糖を含む培地に発育させて、乳糖非分解性でかつアンピシリン感受性となったクローン（AESN1331）を選択した。【結果】PCR及び塩基配列の解析から、AESN1331ではCRP遺伝子が⊿crpに置き換わっていることが確認された。本株は乳糖の他、多数の糖の分解能を欠失し、トリプトファンデアミナーゼ産生性、インドール産生性及びコンゴーレッド吸着能も失っていた。一方、O78血清及びH9血清に対する凝集性には変化がなく、16S rRNA遺伝子の配列より大腸菌であることが確認された。本株を5週齢SPF鶏の静脈内に接種して測定したLD50値は、O78強毒株に比べて約20倍、及び親株に比べて約10倍それぞれ高くなり、鶏に対する病原性が低下した。【考察】CRP遺伝子欠損変異株であるAESN1331では、種々の遺伝子の発現に変調をきたした結果、鶏に対する病原性が低下したものと推察された。
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| ６． |
鶏大腸菌血清型O78菌株由来サイクリックAMPリセプタータンパク質（CRP）遺伝子欠損変異株の作出. 2. 変異株の免疫原性.
永野哲司、北原梨恵、長井伸也
日本生物科学研究所
第146回日本獣医学会学術集会、2008
要旨：【背景及び目的】前演題で作製した鶏大腸菌血清型O78菌株由来CRP遺伝子欠損変異株（AESN1331）の鶏体内での定着性を調べ、次に本株接種後に血清型O78強毒株で攻撃することにより、変異株の免疫原性について調べた。【材料及び方法】試験には4日齢のSPFレイヤーヒナを用い、1群につき10羽を供試した。定着性は、AESN1331または親株(J29)を噴霧接種後、経日的に剖検を行い、接種菌の回収を行うことにより調べた。あわせて病理組織学的検査を実施した。免疫原性は、AESN1331を1羽あたり約107CFUずつ4週間隔で2回噴霧接種し、2回接種後2週に強毒株を静脈内攻撃した後の死亡率で評価した。さらに、ヒナへの２回の接種方法について、噴霧-噴霧及びより実用的な噴霧-散霧接種による有効性について調べた。【結果】定着性については、AESN1331群で接種後1日のみ、J29群で接種後35日までそれぞれ菌が回収された。病理組織学的検索では、AESN1331群で異常は認められなかったが、J29群では肺、心臓及び肝臓に軽度の組織変化を認めた。免疫原性試験では、攻撃後の死亡率は無接種対照群で90%であったのに対してAESN1331接種群では10%であり、接種群の死亡率は有意に低下していた。投与方法については、無接種対照群の死亡率が100%であったのに対して、噴霧-噴霧群で0%、噴霧-散霧群で30%であり、何れの接種方法でも防御効果が認められた。【考察】AESN1331は、接種した鶏の気道に短期間定着したのち、速やかに消失することが判明した。一方、本株を噴霧又は散霧接種した鶏には、鶏大腸菌強毒株の静脈内攻撃に対する防御免疫が付与されることが示された。 |
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Live vaccine for the prevention of avian colibacillosis: a rational attenuated mutant of avian pathogenic E. coli.
Nagano, T., Kitahara, R. and Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
第83回日本細菌学会総会、2010
ABSTRACT: Control of colibacillosis is important to the poultry industry because the economic impact of this disease is overwhelming. Traditionally, antibacterial agents have been widely used for the treatment and control of this disease in poultry flocks. However, residual antibiotics in poultry meat and the emergence of drug-resistant bacteria have led to increasing interest in alternative methods for protecting poultry flocks. Killed vaccines for breeder hens and commercial broiler chickens have been licensed in Japan, but their use is limited because of the difficulty of application. To develop a live vaccine that is more efficient, safe and easy to apply, we constructed an attenuated mutant of avian pathogenic E. coli by an allelic exchange procedure. The mutant strain introduced a deletion in the cyclic AMP receptor protein gene showed markedly reduced virulence and decreased colonization ability in the chicken body. Furthermore, administration of the mutant strain via various routes evoked an effective immune response that could protect against the virulent wild-type E. coli. These findings suggest that the mutant constructed here appears to be a suitable candidate for a live vaccine strain to protect chickens from colibacillosis by avian E. coli.
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| ８． |
Field trials to test safety and efficacy of a live attenuated vaccine of avian pathogenic Escherichia coli serovar O78 in broiler chickens.
Nagano, T., Kitahara, R. and Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
58th Western Poultry Disease Conference (2009)
ABSTRACT:【Introduction】In the 56th Western Poultry Disease Conference, we showed that a rational attenuated crp mutant of avian pathogenic E. coli (APEC) serovar O78 can be a candidate as a safe and effective live vaccine against avian colibacillosis. Administration of the mutant strain via various routes (fine spray, coarse spray, eye drop, and in ovo) evoked an effective immune response that could protect chickens from challenge with the virulent wild-type E. coli O78 strain under laboratory conditions. In this presentation, we will describe the results of the field trials using the mutant strain and will further evaluate safety and efficacy of the mutant as a vaccine candidate.
【Materials and Methods】In four broiler chicken farms where colibacillosis had frequently occurred, a total of 63,208 birds were vaccinated with the mutant strain and 61,508 chickens were served as non-vaccinated control birds. In each farm, approximately 7,400 to 25,500 birds were housed separately. Both sexes of Ross308 chickens were used in Farms A and B, male Cobb500 chickens were used in Farm C and female Ross308 chickens were used in Farm D. The lyophilized trial vaccine (Lot.19, 1,000 doses per vial) was dissolved in 300 ml of sterilized physiological saline. Chickens of Farms A and B were first vaccinated via fine spray at one day of age and were secondarily vaccinated via coarse spray three weeks later. In Farms C and D, chickens were vaccinated twice via fine spray at one day and four-weeks of age. The efficacy and safety of the vaccine were assessed by comparatively monitoring the status of individually housed birds: general clinical signs, existence or nonexistence of colibacillosis, weight gain, and productivity until slaughter and experimental challenge exposure. When clinical colibacillosis was not observed in both the vaccinated and the non-vaccinated birds, ten randomly selected birds from each household were introduced to the authors’ laboratory and experimentally challenge-exposed to the virulent wild-type E. coli O78 strain via intravenously injection. After the challenge exposure, all birds were monitored daily for signs of illness and deaths. One week later, the surviving chickens were euthanized, and gross lesions representing colibacillosis (pericarditis and perihepatitis) were recorded. 【Results】After each vaccination, no adverse symptoms were observed in any of the treated birds. In Farm A, where clinical colibacillosis was observed, mortality and condemnation rates of the vaccinated birds were significantly lowered compared to those of the control. In the other three farms (Farms B, C and D), where clinical colibacillosis was not observed, no significant differences were detected between the vaccinated and control birds except that the mean body weight was higher in the vaccinated birds in Farm C. In the experimentally
challenge-exposed birds, improved results were observed in vaccinated birds; in survival rate and clinical score in Farm B, in survival rate, clinical score and weight gain in Farm C, and in weight gain and pericarditis score in Farm D.【Discussion】In field trials using a total of 63,208 birds, the trial vaccine was shown safe for commercial broiler chickens. The efficacy of the vaccine was indicated by reduction of deleterious effects by the colibacillosis, i.e. reduced mortality rate, clinical scores and other increased productivity. Additionally the trial vaccine protected against the experimental challenge-exposure of APEC strain. The results presented here demonstrate that this vaccine can confer protection against acute and chronic manifestation of colibacillosis caused by APEC infection.
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| ９． |
マウスバベシアを用いたイヌバベシア感染症に対する感染防御効果の検討.
大森崇司
日本生物科学研究所
第148回日本獣医学会学術集会、2009 年
【背景】B. gibsoni感染症は特異的な治療法や予防法が確立されておらず、その対策が望まれている感染症のひとつである。バベシア感染動物では異種のバベシアに対して感染抑制が認められ、バベシアの種間で相同性の高い抗原の存在が示されている。B. microtiはマウスで容易に感染すると同時に、イヌにも感染性を有することが報告されている。【目的】B. microtiを感染させた犬におけるB. gibsoniに対する感染経過を観察する。【材料と方法】イヌにB. microtiを投与後、感染経過を観察した。次いで、B. microtiに感染耐過したイヌをB. gibsoniで攻撃し、感染経過を観察した。同様にB. microtiとは異なるマウスバベシアであるB. rodhainiについても同様の試験を行った。【結果】B. microtiに感染耐過したイヌをB. gibsoniで攻撃した場合、攻撃対照と比較し感染赤血球率の抑制が認められた。一方、B. rodhainiに感染耐過したイヌをB. gibsoniで攻撃した場合、攻撃対照と比較し感染赤血球率の抑制は認められなかった。【結論】B. microtiを用いてB. gibsoni感染における感染赤血球の増加を抑制できる可能性が示唆された。
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鶏壊死性腸炎の実験モデルの作出の試み.
鈴木敬之 , To Ho , 川原史也 , 上塚浩司 , 富岡ひとみ , 土井邦雄 , 布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第148回日本獣医学会学術集会、2009年
要旨：【背景】Clostridium perfringens (Cp)は鶏壊死性腸炎(NE)の原因菌である。NEの実験的な再現例は幾つかの報告が見られるが、いまだ安定したモデル系は確立されていない。我々は実験モデル系の確立を目標として、今回はまずブロイラーへのCpの実験感染を行った。【材料と方法】2週齢のブロイラー20羽を2群に分け、1群にCpを投与し、他の1群は非投与対照とした。給餌には鶏用飼料と魚粉を等量混合した高タンパク飼料を用いた。投与に用いたCpはNE野外症例から分離されたNet B遺伝子保有菌株を選択した。Cpは培養後GAMブイヨン培地で増菌(109 CFU/mL)し、1羽当たり1回2ml、朝・夕2回ずつ5日間投与した。最終投与後翌日に全羽を剖検し肉眼病変及び病理組織学的評価を行った。投与したCpの腸内増殖の確認にはNet B遺伝子をマーカーとして利用した。具体的には、実験鶏の糞便から回収されたCpについてPCRによりNet B遺伝子の有無を確認し、腸管の病理組織標本上で観察される細菌塊についてはin situ hybridization (ISH)によりNet B遺伝子の有無を確認した。【結果】Cp投与群10羽中9羽の小腸に限局性の粘膜の粗造化及び壊死性病変が散在し、組織検査では7羽に絨毛先端部で細菌塊を伴う壊死巣が散在性に認められた。細菌塊はISHによりNet B遺伝子の保有が確認され、腸内容から分離したCpについてもNet B遺伝子が検出された。Cp投与前の鶏の糞便中にはNet B遺伝子保有菌は検出されなかったことから、小腸の病変は投与したCpによって起こったものと考えられた。【考察】本試験ではブロイラーの腸管にNE病変を再現できたものの、野外症例と比較して軽度であった。今後はNE病変の増悪因子並びにNet Bと病変形成の因果関係について更なる検討が必要である。
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新生豚にみられた先天性過骨症の一例.
上塚浩司、鈴木敬之、富岡ひとみ、小川寛人、金子寛子、土井邦雄、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第148回日本獣医学会学術集会、2009年
要旨：【背景】先天性過骨症（congenital hyperostosis）は新生豚にまれに発生し、前肢が著しく腫脹して、死産か生後数日中に死亡の転帰をたどる。その原因については、常染色体性劣性遺伝とする記載もあるが、正確なところは不明である。【目的】今回、新生豚の先天性過骨症の一例を検索したので、その病理組織学的特徴を報告する。【症例】ブタ、雌、０日齢。2009年1月28日朝に分娩されたが、前肢が著しく腫脹しており、生後すぐに死亡した。翌29日に病性鑑定依頼で弊所に到着した。【材料と方法】全身臓器と四肢を採取してホルマリン固定し、パラフィン切片を作製した。必要に応じてギ酸により脱灰した。パラフィン切片はHE染色し、さらに前肢の切片にはアルシアン・ブルー・PAS重染色、ビメンチンに対する免疫染色を行なった。前肢を含む諸臓器について、細菌検査とウイルス検査を実施した。【結果】細菌検査およびウイルス検査では有意な病原体は検出されなかった。肉眼的に左右前肢は高度に硬化、腫脹し、割面では骨の肥大と間質の水腫および増生が見られた。組織学的には、橈骨と尺骨の骨膜下で層板骨表層から線維性骨梁が放射状に伸長する異常増骨が観察された。骨周囲組織は重度の水腫を呈してアルシアン・ブルー染色に陽性を示し、ビメンチン陽性の間葉系細胞の増生が顕著で、軟骨様構造の構築も散見された。骨格筋線維は萎縮し、密度が低下していた。前肢以外には特記すべき変化は見られなかった。【考察】本症例でみられた骨病変は成書に記載されている所見と同様であったが、骨周囲組織での間葉系細胞の増生及び軟骨様構造の構築は我々が調べた限りでは記載が見たらず、病理発生機序にも関連する重要な所見と考えられた。
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| 12． |
猫の腎臓.
鈴木敬之
日本生物科学研究所
第50回獣医病理学研修会、2010年
要旨：【動物】猫、3ヶ月齢、雑種、雌。【臨床事項】症例はA研究所において、研究用に飼育されていたネコで、出生時より成長不良が認められた。2009年6月18日から数回にわたり実施した血液生化学検査より、BUN及びcreatinineの上昇が認められたため、同年6月26日に安楽殺し病理解剖を実施、病性鑑定の目的で左右腎臓が弊所に送られてきた。【肉眼所見】左右の腎臓はどちらも硬結及び一部瘢痕化を呈し、割面では腎皮質の菲薄化が認められた。その他の臓器には肉眼的に異常は認められなかったとのことであった。【組織所見】腎臓では、腎皮質一部表面で瘢痕形成が認められ、腎実質では尿細管の拡張及び結晶状構造物の沈着、尿細管上皮細胞の変性・壊死及び扁平化、一部尿細管間質で軽度から中等度の結合織の増生及びリンパ球浸潤が認められた。尿細管で認められた結晶状物は無色透明～好塩基性、滑車様ないし角柱様の構造を示し、コッサ染色では褐色～黒褐色に染色され、偏光下では複屈折性を示した。またアリザリンレッドS染色ではpH7.0及びpH7.0に2M 酢酸処理を加えた条件下で淡赤色に染色され、pH4.2及びpH7.0に0.1N 塩酸処理を加えた条件下でその染色性は消失した。これらの結果から本結晶構造物はシュウ酸カルシウム結晶と同定された。糸球体ではボーマン嚢に濃縮尿と思われる好酸性漿液物の貯留が散見されたが、PAS染色、PAM染色及びマッソントリクローム染色で毛細血管基底膜の肥厚やメサンギウムの増生は顕著ではなかった。また腎臓表面の血管において石灰沈着を伴う器質化血栓の形成が認められた。電顕検索では尿細管上皮内で放射状構造を示すシュウ酸カルシウム(CaOx)結晶が認められ、またCaOx ghostが尿細管上皮及び尿細管間質で散見された。【診断】病理組織学的には、シュウ酸カルシウム結晶の沈着を伴う尿細管上皮の変性・壊死及び間質性腎炎と診断し、疾患名をシュウ酸塩腎症とした。シュウ酸症は発生機序により原発性と続発性に分類されるが、本症例は室内で管理された食餌で飼育されていたことや、同腹の猫で同様の肉眼病変が観察されていたことから、原発性のシュウ酸塩腎症が疑われた。
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| 13． |
Zuckerラットにおけるカフェインの体重増加抑制効果.
兼田直人、大嶋篤、長谷川也須子、山下龍、渋谷一元
日本生物科学研究所
第36回日本トキシコロジー学会、2009年
要旨：【目的】Zuckerラットは、アルビノラット13C系と黒色ラットM系との交雑種13M系の突然変異として発見され、多食による肥満を呈することで世界的に広く用いられている肥満モデル動物である。一方、カフェインは食品および医薬品中に広く用いられているが、カフェインの体重増加抑制作用については不明な点が多い。本研究では、Zuckerラットにカフェインを経口投与し、体重増加抑制作用について検討した。【方法】10週齢雄のZuckerラットに0、10および50 mg/kg/dayの用量でカフェインを20週齢までの10週間毎日反復経口投与し、一般状態の観察、体重測定、摂餌量測定、飲水量測定、血漿中カフェイン濃度測定、尿検査、血液生化学的検査および病理組織学的検査を実施した。【結果および考察】カフェイン投与により投与量依存性に体重増加抑制が認められ、剖検時(20週齢)の体重は579±52 (50 mg/kg/day)、646±73 (10 mg/kg/day)、673±51 (0 mg/kg/day)であった。50 mg/kg/day群では血漿中AST、ALT、ALP、尿糖、尿中電解質(Na、K、Cl)が高値を示し、血漿中カフェイン濃度は中毒域に達した。また、10 mg/kg/day群では尿糖、尿中電解質(Na、K、Cl)が高値を示したが、血漿中カフェイン濃度は安全域内を推移し、また、摂餌量にも影響はみられなかった。尿糖および尿中電解質(Na、K、Cl)の増加は、カフェインの腎臓におけるNa再吸収阻害作用に関連した変化であると推察されたが、その他の検査項目ではカフェイン投与に起因すると考えられる変化は認められなかった。これらの結果から、10 mg/kg/dayのカフェインの反復経口投与が、Zuckerラットの体重増加抑制に有効かつ安全な用量であると考えられた。現在、肝臓、腎臓、膵臓および脂肪組織の病理組織学的検査を実施中である。
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| 14． |
ウマにおけるLDHAおよびLDHB遺伝子のクローニングと発現解析.
越後谷裕介1)、佐藤哲朗2)、伊藤琢也1)、酒井健夫1)
1)日本大学
2)日本生物科学研究所
第147回日本獣医学会学術集会、2009年
要旨：【目的】ウマの運動時に骨格筋で大量に産生される乳酸は、各組織で異なるサブユニット構成比を持つ乳酸脱水素酵素(LDH)により、可逆的に代謝される。本研究では、LDHのA(骨格筋)型およびB(心筋)型サブユニットをそれぞれコードするウマLDHAおよびLDHBの遺伝子解析を試みた。【方法】ウマLDHAおよびLDHBの全長cDNAは、サラブレッド(Equus caballus)の頚部骨格筋および心筋から抽出された全RNAを用いて、RT-PCR法およびダイレクトシークエンス法により決定した。得られた全長cDNAを用いて、染色体位置、遺伝子構造の決定および系統解析を行った。各組織におけるウマLDHA、LDHBおよびGAPDHの遺伝子発現量は、リアルタイムPCRを用いた比較Ct法によって解析した。【成績】ウマLDHAおよびLDHBの全長cDNAは、それぞれ1,676bpおよび1,295bpであり、それぞれ第7および第6染色体上で8つのエクソンから構成されていた。推定アミノ酸配列の解析により、ウマLDHBは他の哺乳動物で認められているGlu15が欠損し、その全長配列を他の哺乳動物と異にした。またGlu15の欠損は、遺伝子解析したウマ科6種において同様に認められた。三次元構造予測モデルでは、Glu15の欠損によるウマLDHBの構造変化が認められた。ウマLDHAおよびGAPDHの遺伝子発現量は脳で最も高く、骨格筋との相対発現量はそれぞれ約3.9倍および1.9倍であった。ウマLDHBの遺伝子発現量は心筋で最も高く、骨格筋との相対発現量は約3.1倍であった。以上、ウマLDHAおよびLDHBは、ウマ科動物特有の特徴を持つことが示唆された。
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In vitro development of parthenogenetic pig embryos and embryo transfer to NIBS miniature pigs.
Shimatsu, Y., Horii, W., Sakamoto, Y., Sano, J., Saitoh, T. and Yazawa, H.
Nippon Institute for Biological Science
The 56th Annual Meeting of the Japanese Association for Laboratory Animal Science , 2009
ABSTRACT: The purpose of this study was to introduce two techniques of in vitro development of parthenogenetic pig embryos and embryo transfer (ET) to miniature pigs (NIBS, Nippon Institute for Biological Science). Fresh pig ovaries were purchased from Yamanashi Meat Logistics Center Co., Ltd. and oocytes were collected from them. The oocytes that were cultured in Medium 199 for 42 hours were removed in a mannitol-based solution, and then activated with an electric stimulus by an electro cell fusion generator. In the 1st experiment, the oocytes were activated by a single DC pulse of 1.3-3.3 kV/cm 60 seconds and then cultured in Porcine Zygote Medium for 192 hours. In the monitoring parthenogenetic blastocyst formation, the highest value (42.1%) was in the 1.7 kV/cm-electric-treatment. In next series of experiments, the embryos that were activated by a single DC pulse of 1.7 kV/cm 60 seconds were transferred to 3 NIBS miniature pigs by an exploratory laparotomy. The miniature pig's estruses were controlled by the altrenogest-drug treatment. On 25-26 days after the ET, two of the three miniature pigs were pregnant and litter sizes were 4 and 5, respectively. These results suggest that some techniques for a somatic cell nuclear transfer system succeed in mastering.
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国内初のミニブタ（NIBS系）をクローン胚移植用レシピエントとしたGalT-KOミニブタの作出とそのブタ腎を用いたGalT-KOブタ・サル異種間腎移植.
山田和彦1)、島津美樹2)、田﨑正行1)、堀井渉2)、西村博昭1)、齋藤敏樹2)、佐原寿史1) 、
瀬戸山健太郎1)、布谷鉄夫2)
1)鹿児島大学
2)日本生物科学研究所
第13回日本異種移植研究会、2010年
要旨：【背景と目的】筆頭演者は、これまでにMGH・GalTノックアウト（GalT-KO）ミニブタをドナーとしたヒヒへの異種腎移植において、独自の免疫寛容誘導療法を併用することによって、異種移植腎が80日以上の正常クレアチニン（Cre）値を維持し、平均生存日数も50日を超え、ブタ・霊長類異種腎移植で最も良い成績を報告している。しかし、術後早期からのタンパク尿出現は、異種腎移植臨床応用に向けての対応課題の一つである。また、今後日本での異種移植を視野に入れた場合、前臨床研究の推進およびドナー確保の両面から、国内におけるGalT-KOブタの生産とその性能試験が必要である。我々は異種移植の国内での臨床応用を目指し、鹿児島大学において平成18年度からまず同種移植実験を開始し、年間150例以上の手術を施行し、MHC確立ミニブタを用いた同種腎・肺・膵島移植の慢性実験モデルを確立した後、平成19年度からは、国内でのGalT-KOおよびGalT-KOプラス遺伝子導入ブタの作出、更にその臓器を用いた移植プロジェクトを開始した。今回、我々は小スペースで飼育が可能なNIBS系ミニブタ（（財）日本生物科学研究所、山梨県北杜市小淵沢町）へ、核移植技術により作出したMGH・GalT-KOミニブタ体細胞クローン胚を移植することでGalT-KOミニブタの作出に成功し、そのGalT-KOブタ左腎を用いた国内第一例目の国産GalT-KOミニブタ・サル間腎移植を行ったので結果を報告する。【材料と方法】MGH・GalT-KO新生ミニブタの胸腹部大動脈内皮細胞を日本生物科学研究所において屠殺場由来の家畜ブタ卵子に核移植することで作出したクローン胚をNIBS系ミニブタに移植し、GalT-KOミニブタを作出した。生後3カ月齢時に鹿児島大学に空路輸送し、Survival Procedureとして左腎を摘出しサルへ異種腎移植を行った。レシピエントには筆頭演者がこれまで米国で行っている異種腎移植プロトコールと同様の治療に加え、タンパク尿抑制目的としてsoluble thrombomodulin (sTM) を移植日を含め短期間追加した。【結果】MGH・GalT-KOミニブタ体細胞クローン胚をNIBS系ミニブタに移植することで作出したGalT-KOミニブタは、誕生後、山梨から鹿児島への輸送および左腎摘出手術の侵襲にも耐え、現在も順調に生育している。異種腎移植後のサルのCre値は正常域（<1.2mg/dl）を維持し、他のグループから報告される術後1-3日目の一過性Cre上昇や血小板減少も認めなかった。タンパク尿はこれまでの米国での自験症例に比較し明らかに軽微であった。Day14に薬剤性と思われる高血糖が生じ、薬物による治療効果が不十分なため、Day15に病理学的検討を優先する目的でサルを犠牲死させた。異種移植腎には拒絶像は認めず、腹部、胸部に異種移植後出血傾向などを示唆する所見も認めなかった。【考察】国内初の国産ミニブタを核移植レシピエントとしたGalT-KOミニブタ作出に成功し、国内初の国産GalT-KOブタからサルへの異種腎移植を行い、術後2週間にわたり拒絶を認めず、正常Creを維持した。Preliminary Dataであるが、sTMによるタンパク尿軽減効果が示唆された。本成功を第一歩として、今後、経験を積んだブタ作出チームと大動物移植チームの協力のもとで、臨床異種移植の実現を目指していく。
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