口頭発表2011年（平成23年）

The epitope mapping of BLV envelope protein for disease susceptibility cattle determined by major histocompatibility complex class II DRB3 allele.

Takeshima, S.¹⁾, Hagiwara, K.¹⁾, Matsumoto, Y.¹⁾, Kim, J.¹⁾, Miyasaka, T.¹⁾,
Jimba, M.¹⁾, Hebishima, T.¹⁾, Ohmori, T.²⁾, Nunoya, T.²⁾, Matoba, K.³⁾ and Aida, Y.^1)
1)Viral Infectious Diseases Unit, RIKEN ,²⁾ Nippon Institute for Biological Science,
³⁾National Institute of Livestock and Grassland Science
The XXV Symposium of the International Association for Comparative Research on Leukemia and Related Diseases, 2011
Abstract: Bovine leukemia virus, which is near relative retrovirus for human T cell leukemia virus, induces malignant B cell lymphoma to infected cattle in low incidence rate. Our and several other lab reported that the susceptibility for BLV diseases progression was associated with cattle major histocompatibility complex (BoLA) class II allele. Our previously study determined that cattle which had BoLA-DRB3*1601/*1601 genotype tend to onset Enzootic bovine leukemia and indicates high proviral load. Because of one of the major problem to develop the BLV vaccine is unstable effect of the vaccine because of the individual difference, we determined to develop the BLV vaccine for disease susceptibility cattle. The vaccine will be suppress the proviral load of BLV-infected, susceptibility, high proviral load cattle and it will result to suppress the spread of BLV.  We genotyped 90 head of Japanese black cattle by using our developed BoLA-DRB3 PCR sequence based typing method and also detected BLV provirus by also our developed BLV-CoCoMo-qPCR method. One BLV infected susceptibility cattle, homozygote of BoLA-DRB3*1601 allele, was found and the cattle was used to immunological assay. To determine the T cell epitope for BLV antigens in susceptibility cattle, we purified CD4 positive cells from peripheral blood lymphocyte by using ILA11A monoclonal antibody. Remained CD4 negative cells were irradiated and used for antigen presenting cells (APCs). APC and CD4 positive cells (5 x 105) were cocultured with 10 μM synthesis BLV peptides or BLV antigens for 5 days. Before 16 hours of the termination of culture, 1 mCi/ml of [3H]-TdR were added to each well. After finish the culture, cells were corrected to filter paper and measurement the radioactive count by scintillation counter. We also constructed 20-mer of synthesis 10-mer overlapping peptides for p12, p15 and p24 BLV gag proteins and used for proliferation assay. p12-4 peptide derived from p12 protein induced CD4 proliferation and the peptide induced high level of IFN-γsecretion from CD4 positive T cells. This result showed p12-4 act as Th epitope in diseases susceptibility cattle. In this study, we identified CD4 T cell epitope of BLV susceptibility cattle. For design novel BLV vaccine for designed to susceptibility cattle, candidate antigen will be designed based on the information of our determined Th epitope.  Additionally, our strategies for design vaccine for susceptibility individuals are effective for every disease which is associated for MHC alleles, such as adult human leukemia, Hepatitis C virus infection, human immunodeficiency virus etc.

The epitope mapping of BLV envelope protein for disease susceptibility cattle determined by major histocompatibility complex class II DRB3 allele.

竹嶋伸之輔¹⁾、萩原恭二¹⁾、松本有生¹⁾、金智潤¹⁾、宮坂卓¹⁾、神馬繭子¹⁾、蛇島武久¹⁾、
大森崇司²⁾、布谷鉄夫²⁾、的場和弘³⁾、間陽子^1)
１)理化学研究所、²⁾日本生物科学研究所、^３)畜産草地研究所
第4回HTLV-1研究会、2011年
Abstract: Bovine leukemia virus, which is near relative retrovirus for human T cell leukemia virus, induces malignant B cell lymphoma to infected cattle in low incidence rate. Our and several other lab reported that the susceptibility for BLV diseases progression was associated with cattle major histocompatibility complex (BoLA) class II allele. Our previously study determined that cattle which had BoLA-DRB3*1601/*1601 genotype tend to onset Enzootic bovine leukemia and indicates high proviral load. Because of one of the major problem to develop the BLV vaccine is unstable effect of the vaccine because of the individual difference, we determined to develop the BLV vaccine for disease susceptibility cattle. The vaccine will be suppress the proviral load of BLV-infected, susceptibility, high proviral load cattle and it will result to suppress the spread of BLV. We genotyped 90 head of Japanese black cattle by using our developed BoLA-DRB3 PCR sequence based typing method and also detected BLV provirus by also our developed BLV-CoCoMo-qPCR method. One BLV infected susceptibility cattle, homozygote of BoLA-DRB3*1601 allele, was found and the cattle was used to immunological assay. To determine the T cell epitope for BLV antigens in susceptibility cattle, we purified CD4 positive cells from peripheral blood lymphocyte by using ILA11A monoclonal antibody. Remained CD4 negative cells were irradiated and used for antigen presenting cells (APCs). APC and CD4 positive cells (5 x 105) were cocultured with 10 μM synthesis BLV peptides or BLV antigens for 5 days. Before 16 hours of the termination of culture, 1 mCi/ml of [3H]-TdR were added to each well. After finish the culture, cells were corrected to filter paper and measurement the radioactive count by scintillation counter. We also constructed 20-mer of synthesis 10-mer overlapping peptides for p12, p15 and p24 BLV gag proteins and used for proliferation assay. p12-4 peptide derived from p12 protein induced CD4 proliferation and the peptide induced high level of IFN-γsecretion from CD4 positive T cells. This result showed p12-4 act as Th epitope in diseases susceptibility cattle. In this study, we identified CD4 T cell epitope of BLV susceptibility cattle. For design novel BLV vaccine for designed to susceptibility cattle, candidate antigen will be designed based on the information of our determined Th epitope.  Additionally, our strategies for design vaccine for susceptibility individuals are effective for every disease which is associated for MHC alleles, such as adult human leukemia, Hepatitis C virus infection, human immunodeficiency virus etc.

ワクチン効果を評価するための牛を用いたBLV感染実験．

大森崇司、上塚浩司、鶴山愛、富岡ひとみ、武藤隆司、石川善己、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
平成23年度日本獣医師会獣医学術学会年次大会（北海道）シンポジウム　
牛白血病の新しい制圧戦略
要旨：開発ペプチドのワクチン効果の検証には、対象動物である牛を用いたBLV感染実験系の確立が必要である。野外感染牛では、その病態進行に長い時間が必要であることに加え、末梢血中のリンパ球数やプロウイルスロード等といった病態進行の指標の変動が緩やかであることから、ワクチン評価は困難である。従って、可能な限り短期間で病態が進行し、病態進行の指標の変動が明瞭である実験感染牛での試験系を確立する必要がある。そこで、BLV感受性牛にBLV感染白血球を大量投与し、その後の病態進行を観察した。加えて、BLV感受性牛での病態進行の検証のため、比較対照としてBLV抵抗性牛を用いた。生後2～3か月齢のBLV感受性牛ならびにBLV抵抗性牛各1頭にそれぞれウイルス供給牛の全血1Lから調整した白血球を頸静脈より投与した。白血球数とリンパ球数の推移を観察するために、自動血球計算機を用いた測定を行った。また、BLVは主にCD5陽性IgM陽性細胞に感染する事から、フローサイトメトリー法による末梢血単核球中のCD5陽性IgM陽性細胞の検出を行った。そして、BLVは宿主細胞のDNAに組み込まれプロウイルスとして存在し、宿主細胞の分裂増殖に伴い増殖する事から、リアルタイムPCR法による末梢血単核球中のプロウイルス量の測定を行った。加えて、末梢血単核球を用いたシンシチウムアッセイ法によりウイルス力価を計測した。白血球数は感受性牛において投与10日後から上昇が認められ、投与21日後に最高値を示し、その後も高値を維持した。リンパ球数は投与10日後より上昇を認め、投与21日後に最高値を示し、その後も投与前と比較し高値を維持した。一方、抵抗性牛では白血球数、リンパ球数ともに大きな変動は認められなかった。末梢血単核球中のCD5陽性IgM陽性細胞は感受性牛において投与7日後より上昇を認め、その後は投与前と比較して高値を維持したのに対し、抵抗性牛では観察期間中に大きな変動は認められなかった。 CD5陽性IgM陽性細胞を含む末梢血単核球から検出されるプロウイルスは、感受性牛では投与3日後から検出され、投与21日後に最高値を示し、その後は高値を維持した。 一方、抵抗性牛では投与10日後に検出され上昇を認めたものの、その程度は感受性牛よりも低かった。シンシチウム数は、感受性牛では投与14日後より検出されて以降、投与70日後まで上昇を認め、その後は高値を持続した。抵抗性牛では投与28日後より検出されたが、検査実施日毎に高値と低値を繰り返す傾向が認められた。これまでの報告から、BLV感染の初期病態としてリンパ球数が増加する事や、BLVはCD5陽性IgM陽性細胞に感染した場合にのみ宿主細胞のDNAにプロウイルスとして存在し、宿主細胞の分裂増殖に伴い増殖する事が知られている。今回得られた結果は、このようなBLV感染による病態進行のメカニズムと状況がよく符合している事から、本接種法によってBLV感染後にリンパ球増多症、白血病へと続く病態進行を、短期間で再現できる可能性が高いと考えられた。即ち、感受性牛では、持続性リンパ球増多症もしくはその前段階の病態が再現されたものと推察され、比較的短期間での病態解析やワクチン効果判定が可能な試験系であると考えられた。さらに、抵抗性牛を比較対照とする事で、感受性牛における病態進行との比較評価により、「ペプチドワクチンの有効性評価」や「宿主免疫応答評価」の解析が、より詳細に実施可能と考えられた。しかし、現行の接種方法では、試験実施のためにウイルス供給牛からの膨大な血液量が必要となるため、さらに少量の血液量での接種方法を検討中である。加えて、BLV実験感染牛の個体数を増やし、今回の成績の再現性を確認中である。

複数種の細菌感染を伴う豚サイトメガロウイルス病の解析．

鈴木敬之、平修、佐藤哲朗、田積晃浩、上塚浩司、富岡ひとみ、長尾亜貴、土井邦雄、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第153回日本獣医学会学術集会、2012年
要旨：【背景と目的】豚サイトメガロウイルス(PCMV)は哺乳豚などで全身感染及び封入体鼻炎を惹起し、また肺胞マクロファージに感染することで豚呼吸器複合病への関与も示唆される。今回複数種の細菌感染を伴う豚サイトメガロウイルス病の症例について解析した。【材料と方法】SPF母豚より娩出された25日齢の哺乳豚で、鼻端部のチアノーゼ、漿液性～膿性の鼻汁漏出、呼吸促迫を呈する2頭を鑑定殺し、剖検した。一部臓器及び鼻腔スワブについて、PCRによるPCMVの検出、Multiplex PCR及びRT-PCRによる豚に感染する主要ウイルスの検出並びに細菌分離を行った。また全身臓器について病理組織学的検索及びin situ hybridization(ISH)によるPCMVの検出を試みた。【結果】剖検では両個体で鼻孔の狭窄、腎臓の褪色及び針先大点状出血、肺前葉から中葉で充実性・褪色あるいは暗赤紫色調への変色が見られた。PCRでは2頭の鼻腔スワブと1頭の腎臓からPCMVが検出され、他のウイルスは検出されなかった。また肺及び鼻腔スワブからはヘモフィルス・パラスイス、ストレプトコッカス・スイス及びパスツレラ・ムルトシダが分離された。病理検査では両豚で封入体鼻炎、カタル性気管支肺炎、非化膿性髄膜炎あるいは化膿性髄膜脳炎が認められた。また好塩基性核内封入体が鼻粘膜粘液腺上皮細胞、腎盂集合管上皮細胞ないし血管内皮細胞、肺胞マクロファージにおいて認められ、同細胞はISHに陽性を示した。【考察】今回の症例ではPCMVと複数の細菌感染により重度の病変形成が見られ、肺胞マクロファージへのPCMV感染も確認された。以上よりPCMVは豚呼吸器複合病の一因子である可能性があり、本ウイルス感染への注意が必要であると考えられた。

Live vaccine for the prevention of avian colibacillosis: a rational attenuated mutant of avian pathogenic E. coli.

Nagano, T., Kitahara, R. and Nagai, S.
Nippon Institute for Biological Science
International Union of Microbiological Societies 2011 Congress, Sapporo
Abstract: Control of colibacillosis is important to the poultry industry because the economic impact of this disease is overwhelming.  Escherichia coli serovars O1, O2 and O78 are frequently isolated from birds affected with collibacillosis.  Avian pathogenic E. coli causes a variety of disease manifestations including septicemia, peritonitis, granuloma, and cellulitis in poultry.  Traditionally, antibacterial agents have been widely used for the treatment and control of this disease.  However, residual antibiotics in poultry meats and the emergence of drug-resistant bacteria have led to increasing interest in alternative methods of protecting poultry flocks against colibacillosis.  Various types of experimental vaccine have been reported over the past three decades for control of colibacillosis.  A bacterial subunit vaccine for breeder hens and a disrupted whole cell vaccine for commercial broiler chickens have been licensed in Japan.  However, their use is limited because of the difficulty of application.  To develop a live vaccine that is more efficient, safe and easy to apply, we constructed an attenuated mutant of avian pathogenic E. coli O78, which was deleted the gene encoding a cyclic AMP receptor protein by an allelic exchange procedure.  Administration of the mutant strain via various routes (fine spray, coarse spray, eye drop, and in ovo) evoked an effective immune response that could protect chickens from challenge with the virulent wild-type E. coli O78 strain under laboratory conditions.  In field trials using a total of 63,208 birds, the trial vaccine was safe for commercial broiler chickens without showing any adverse reactions.  The efficacy of the vaccine was shown by the reduction of deleterious effects by the colibacillosis, i.e. reduced mortality rate, clinical scores and poor productivity.  In this presentation, we characterized the crp mutant from immunological and safety aspects and also evaluated the mutant for potential candidate as a live vaccine strain against colibacillosis.

Oral rice-based vaccine induces active and passive immunity against enterotoxigenic E. coli-mediated diarrhea in pigs.

鶏壊死性腸炎の実験モデル構築.

わが国におけるNetB毒素遺伝子陽性Clostridium perfringensの分離状況．

SPFレイヤー鶏を用いた鶏壊死性腸炎実験モデルの構築．

川原史也、魚谷勇介、鈴木敬之、上塚浩司、布谷鉄夫
日本生物科学研究所
第152回日本獣医学会学術集会、2011年
要旨：【背景】鶏壊死性腸炎の実験的な再現は困難であり、世界でも再現に成功している研究グループは少ない。我々はこれまでに、商用ブロイラー鶏を用いて鶏壊死性腸炎を実験的に再現する試みを報告した（鈴木ら、第148回日本獣医学会学術集会）。今回は実験動物として利用されているSPFレイヤー鶏を用いた感染モデルの構築について報告する。【材料と方法】白色レグホン系のSPF鶏（Line-M）を使用し、通常飼料に等量に魚粉を混合して給餌した。野外症例から分離されたNetB毒素遺伝子を保有するClostridium perfringens （Cp）を鶏に4日間連続で経口投与し、5日目に試験を終了した。一部の群は、鶏コクシジウム原虫Eimeria maxima（Em）強毒株を感染させた。【結果】Cp投与群、Em投与群および非投与対照群では鶏に臨床的異常は認められなかったが、CpおよびEmを共に投与した群（共感染群）では元気消失、沈鬱および下痢便など顕著な臨床症状が認められ、死亡する個体もあった。さらに、共感染群では試験期間中に鶏の体重が顕著に減少した。共感染群では死亡鶏、生残鶏ともに腸管粘膜面に顕著な肉眼的な病変が認められた。【総括】SPFレイヤー鶏を用いる実験であっても、CpとEmを共感染させることによって鶏壊死性腸炎を再現できた。野外においても、鶏壊死性腸炎を誘発する最も大きな要因は鶏コクシジウム原虫の感染であると言われている。今回、我々が構築した実験モデルは、鶏壊死性腸炎の病態の発生機序の解析や予防・治療法の評価および確立に極めて有用である。

わが国におけるNetB毒素遺伝子陽性Clostridium perfringensの分離状況．

17β-estradiol(E2)を混餌投与した雄のニホンウズラの腎糸球体病変の進展過程．

山下龍、大嶋篤、渋谷一元、土井邦雄
日本生物科学研究所
第153回日本獣医学会学術集会、2012年
要旨：【はじめに】鳥類のvitellogenin (VTG)はE2の刺激によって肝臓で産生される卵黄蛋白前駆物質である。我々は2008年の日本毒性病理学会で、E2(30 ppm)を6週間にわたり混餌投与した雄のニホンウズラで、血中VTG濃度の高度の増加ならびに好酸性物質の貯留による毛細血管腔の拡張および基質の沈着・メサンギウム細胞の増数によるメサンギウム領域の拡大を特徴とした、VTGの沈着を伴う高度の腎糸球体病変について報告した。今回は、腎糸球体病変の進展過程を、血中VTG濃度の推移とともに経時的に観察した。【材料と方法】10週齢の雄のWE系ニホンウズラにE2を30 ppmの濃度で1、3および5週間にわたり混餌投与した。各投与期間の翌日に剖検し、血中VTG濃度を測定するとともに、腎臓について病理組織学的、免疫組織化学的および電顕的検索を行った。【結果と考察】投与１週後には既に、血中VTG濃度の有意な増加と前報と同様な病理組織学的・免疫組織化学的性状を有する軽度の腎糸球体病変が認められ、投与期間の増加に伴い血中VTG濃度はより増加し、糸球体病変の程度は増強した。電顕的検索では、投与3週後以降、拡張した毛細血管腔内に小脂肪滴を含む微細顆粒状物が貯留し、メサンギウム領域には基質物質の増加と脂肪滴を貪食したメサンギウム細胞の増数が目立った。加えて、投与5週後にはpodocyteの足突起の融合が認められた。上述した雄のニホンウズラで観察された腎糸球体病変は、外因性のE2によって肝臓で産生されたVTGが卵黄蛋白として利用されず、循環系を介して腎糸球体に集まった結果惹起されたものと推察された。

リアルタイムPCRをもちいた豚サイトカインmRNAの発現解析法．

竹山夏実
日本生物科学研究所
動物用ワクチン‐バイオ医薬薬品研究会シンポジウム、2011年
要旨：獣医畜産領域では、ワクチン効果や感染履歴を把握するために、抗体産生を指標としている。一方で、昨今、基礎研究の成果が蓄積され、複雑な免疫現象がサイトカインや細胞表面マーカー等によって整理されつつある。したがって、感染の評価やワクチンの予防効果に対して、より高次な評価系を構築すべきである。中でも種々の細胞から産生されるサイトカインは、感染による炎症反応、自然免疫から獲得免疫への橋渡し、更には獲得免疫の中枢を担うCD4陽性T細胞の活性化を制御する。すなわち、サイトカインの産生レベルを測定することで動物の免疫状態・バランスのモニターが可能である。サイトカイン産生には抗体誘導と比較して、感染やワクチン接種後の早期から変化が認められるため、免疫応答の早い段階における個体の変化を捉えることが出来る。豚を対象としたサイトカイン測定方法としては、ELISAも次第に充実してきているが、複数のサイトカインを網羅的に解析する手法として、リアルタイムPCRを活用したmRNAの定量法(qRT-PCR)に着目している。塩基配列情報が分かっていれば、qRT-PCRは特別な材料を準備することなく応用可能なため、多くの研究で使われているが、標準化が困難であり、定量性・再現性に問題がある。今回はqRT-PCRの中で、比較定量法（比較Ct法）を用いたサイトカインmRNA定量法を紹介する。比較Ct法は検量線を必要とせず、内在性コントロール遺伝子により標準化する定量法である。比較Ct法では正確な測定のために、いくつかの定量条件をあらかじめ検討する必要がある。すなわち、１）組織サンプルからのRNA抽出法、２）内在性コントロール遺伝子の決定、３）PCRにおける各プライマーの増幅効率の確認、４）検出限界値の確認、である。我々は豚の血液・組織より抽出したRNAから比較Ct法によってサイトカイン、転写因子、Toll様受容体のmRNAを測定する手法を確立した。本シンポジウムでは、１）～４）までの検討事項について実例をあげて紹介し、また、若干の感染試験例において比較Ct法を応用したサイトカインmRNAの定量結果について考察したい。

組換え犬顆粒球コロニー刺激因子の犬における抗原性の評価．

山元哲、武藤隆司、土屋剛嗣、岩田晃
日本生物科学研究所
第153回日本獣医学会学術集会、2012年
要旨：【目的】小動物臨床では癌化学療法の補助薬として、組換え人顆粒球コロニー刺激因子(以下G-CSF)が使用される場合がある。しかし、長期使用するとG-CSFに対する抗体が産生される危険性があり、犬G-CSF製剤が待望される。我々は犬G-CSFを遺伝子組換え技術により発現、精製した。今回、この試験品の犬における抗原性を人G-CSF製剤と比較した。【材料と方法】組換え犬G-CSFは2.5 µg/kg/dayで1日1回2日間連続しての反復皮下投与を9週間繰り返した。3か月齢の試験犬10頭を使用し、4頭は対照薬投与群として人体用のG-CSF(組換え型)を投与した。投与による効果の判定は投与前と投与翌日に採血を行い、末梢血中の好中球数を測定することにより行った。また、G-CSFに対する抗体の産生は、末梢血より分離した血清中の抗体をELISA法によって測定した。ELISA法は測定精度試験、再現性試験、希釈直線性によりバリデーションを行い、被験血清中の抗体測定は信頼性が十分であることを確認した。【結果と考察】ELISAにより得られたOD値よりE値を算出し、抗体価を示す指標とした。抗体産生が認められた個体の割合は犬G-CSF投与群で50%(6頭中3頭)、対照薬投与群で75%(4頭中3頭)であった。また、抗体産生が認められた犬においても、犬G-CSF投与群では対照薬投与群に比べてE値が1/6程度であった。対照薬投与群で抗体価上昇がみられた3頭は、試験4～5週からG-CSF投与による好中球数の増加がみられなくなり、G-CSFに対する抗体による干渉が示唆された。一方、犬G-CSF投与群では全個体で試験期間中、犬G-CSF投与による効果が維持された。以上より、犬G-CSFは
人G-CSF製剤と比較して抗体産生誘導によるG-CSF効果消失の危険性が低いことが示された。

ラットの卵巣結節．

山下龍
日本生物科学研究所
第52回獣医病理学研修会、2012年
要旨：［動物］ラット、F344/DuCrlCrj、雌、90週齢。［臨床事項］発がん性試験に用いた対照群の動物で、試験84週に自発運動の低下を示し、同週に死亡した。死因は下垂体腫瘍と考えられた。［剖検所見］7 x 4 x 3 mm大の淡桃色、表面滑沢な軟結節が、左側卵巣に堅固に付着していた。［組織所見］結節は、付着していた卵巣の表層上皮と連続性のある単層の立方状からやや扁平の上皮様細胞に覆われた乳頭状・管状増殖からなり、間質は微小血管を含む線維性結合組織により構成されていた。上皮様細胞は細胞質に乏しく、類円形～長楕円形の淡明な核を有していた。複雑な乳頭状・管状増殖により形成された内腔には、大小の細胞質内空胞を多数有する大型の細胞が充満していた。空胞化細胞は円形～類円形の淡明な核を有し、一部の細胞の細胞質内に大小の好酸性滴状物が観察された。これらの滴状物はジアスターゼ耐性、PAS陽性、アルシアンブルー陰性を示した。いずれの細胞も異型性に乏しく、核分裂像は稀であった。免疫染色において、乳頭状・管状増殖を示す上皮様細胞はcytokeratin AE1/AE3陽性、vimentin陽性であり、中皮由来の卵巣表層上皮と同様の染色性を示した。一方、空胞化細胞はcytokeratin陰性、vimentin陽性であった。鍍銀染色により、乳頭状・管状増殖を示す上皮様細胞には基底膜が観察されたが、内腔の空胞化細胞には好銀線維はほとんどみられなかった。［診断］ラットの卵巣の管状間質腺腫（Tuburostromal adenoma）［考察］管状間質腺腫は卵巣の上皮性腫瘍のひとつであり、マウスでは比較的高い発生率を示すが、ラットでは稀とされる。げっ歯類において、本腫瘍は卵巣の表層上皮のdowngrowthにはじまり、表層上皮に類似あるいは連続する立方状上皮細胞の管状増殖および性索-間質由来とされる空胞化あるいは黄体化した細胞の増殖を特徴とし、本腫瘍の組織像と一致した。成書に記載されている典型的な組織像とは少し異なるが、卵巣の表層上皮と性索-間質由来と考えられる2つの成分の増殖が認められたことから管状間質腺腫に相当すると考えられた。［参考文献］Alison, R. and Morgan, K. 1987. Ovarian neoplasms in F344 rats and B6C3F1 mice. Environ Health Perspect. 73:91-106.

Eimeria brunettiによる鶏コクシジウム症の予防法の確立．

川原史也
日本生物科学研究所
シンポジウム「家畜衛生等技術のこれから～民間の力を生かして」、2011年
要旨：産業動物の感染症対策において、ワクチンの重要性は極めて高い。集約的な飼育形態で感染症が発生した場合、その伝播は早く、被害も深刻化することが多いために、予防的な対策が望まれるからである。これまでにウイルス、細菌による感染症を制御する手段として多くのワクチンが実用化されてきた一方で、寄生虫対策として実用化されているワクチンは極めて少ない。多くの寄生虫が複雑な生活環を営む上に、多様な抗原を保有することから、その研究が困難なためであろう。鶏コクシジウム症ワクチンは、寄生虫分野では唯一と言って良い程の大きな成功を収めたワクチンである。現在までに国内外ともに研究開発が進み、多くのワクチンが製造販売されている。歴史を振り返ると野外分離株を利用した鶏群の計画感染に端を発する鶏コクシジウム症ワクチンであるが、今日に至って世界中で広く普及することになった最も大きな要因は、鶏コクシジウム原虫を弱毒化する実用的な技術が確立されたことである。鶏の体内で早期に増殖する原虫集団のみを次代に用いる極めてユニークな継代方法を重ねて得られる系統は、早熟株もしくは早熟化弱毒株と呼ばれている。そもそも宿主体内で早く増殖する病原体を選抜する方法では、その病原性が高まり強毒化しても不思議ではないが、本原虫の早熟株は親株と比較して顕著に弱毒化した性状を示す。しかも、早熟株は親株と変わらず免疫原性を保有することから、安全で有効な生ワクチン株として多くの製剤で採用されることとなった。我々はこれまでに4種の鶏コクシジウム原虫、E. tenella、E. acervulina、E. maximaおよびE. necatrixの早熟株を作出することに成功してきた。国内では、これらの株を利用したものも含めて3つの製剤が製造販売され、種鶏および特別飼育鶏の農場を中心に普及している。しかしながら、近年、これらのワクチンを利用した鶏群においても、鶏コクシジウム症の発生事例が散発する傾向が見られるようになった。その原因を究明するために我々が実施してきた病性鑑定や疫学調査の結果、従来、あまり認知されてこなかったE. brunettiが国内に広く浸潤し被害を及ぼしていることが明らかとなった。本種の汚染は種鶏農場で多く認められ、卵や雛を安定生産する上で非常に大きな障害となっているが、未だ国内ではワクチンは開発されていないために被害の発生が続いている状況にある。産業動物においてはワクチンなど疾病の予防対策は重要な位置付けにあるにもかかわらず、疾病の発生リスクをマネジメントする保険的な意味合いが強いために、他の経費と比べると優先的に抑制される傾向が強い。実際に鶏の疾病対策では一つの疾病に宛がわれる経費は一般的には羽当たり数円から数十円程度、低いものでは1円を下回る状況にある。このような状況下では、優れた基盤技術を保有していたとしてもメーカーが研究、開発および製造のサイクルを回しながら、リスクの大きい革新的な製剤やマーケットが限られる製剤の研究を単独で進めていくことは極めて困難である。我々が手掛けてきた国内初となるE. brunettiのワクチン開発も、当初は限られた研究費で遂行せざるを得ない状況であったが、幸いにも「民間活力による家畜衛生等技術研究開発推進事業」から助成いただく機会に恵まれ、大きくその研究開発を進展させることができた。今後も、このように産官学や産学および産産などの連携により、お互いの強みを活かしながら、かつリスクを分散する形で研究開発が進められていけば、より一層優れた国内の家畜衛生等技術が見直されて、広く活用されていくであろう。

鶏コクシジウム症対策の課題．

川原史也
日本生物科学研究所
第25回日本動物原虫病学会、2011年
要旨：鶏コクシジウム症の発生は、集約的な養鶏生産において避けて通ることができない問題の一つである。本症は、生産成績を悪化させて甚大な経済的被害をもたらすことから、養鶏産業において極めて重要視されてきた。これまでに多くの研究機関、製薬企業が本症の研究に取り組み、日本の研究者も含めた先人達により鶏コクシジウム症生ワクチン、抗コクシジウム予防剤および治療剤が開発されてきた。実用化されてからすでに長い年月を経たが、未だに多くはその有用性を堅持し続けている。しかしながら、これまでに本症の原因となる鶏コクシジウム原虫を我々が制圧できたと言える状況にはないし、おそらくいつまでも根絶することはできない。現在でも、本症の発生による損失およびその予防と治療に必要な経費を合算すると、世界全体で年間2,000億円を下らないと言われている。いくつもの実用的な制御方法が開発されているにもかかわらず、未だに問題を解消できないのは、本原虫がもとより鶏と周辺環境に適応して進化を遂げている上に、その生態は現在の集約的な養鶏生産に極めて適合しているためである。また、すでに実用化されている鶏コクシジウム症生ワクチン、抗コクシジウム予防剤および治療剤においても、その効果を得るために色々と条件が付随したり、使用できる期間が制限されたりと、まだ改善すべき点がある。産業動物においてはワクチンなどの疾病対策に関わる経費は、その発生リスクをマネジメントする保険的な意味合いが強く、他の経費と比べると優先的に抑制される傾向が強い。鶏の疾病対策では、一つの疾病に宛がわれる経費は一般的には羽当たり数円から数十円程度、低いものでは1円を下回る状況にある。このような状況では、動物薬メーカーが研究、開発および製造のサイクルを回しながら、よりリスクの大きい革新的な製剤やマーケットが限られる製剤の研究を単独で行うことは極めて困難である。従って、本症を制圧するために既製剤の改善もしくは新たな方法を確立する上でも、産官学や産学および産産などの連携により、お互いの強みを活かしながら、かつリスクを分散する形式で研究開発を進める必要があるのではないだろうか。本演題では、鶏コクシジウム症生ワクチンに関する話題を中心に、鶏コクシジウム症対策における現状およびその問題点の分析、ならびに今後どうすれば克服していけるのか、新たな戦略について概観してみたい。

動物用ワクチンの変遷と感染症の制圧・排除･根絶．

土屋耕太郎
日本生物科学研究所
第72回日本獣医史学会研究発表会、2011年

臨床応用を目指したブタ･サル間異種移植実験．

佐原寿史¹⁾、長嶋比呂志²⁾、齋藤敏樹³⁾、島津美樹³⁾、伊達洋至⁴⁾、山田和彦^1)
1)鹿児島大学フロンティアサイエンス研究推進センター、²⁾明治大学農学部、
³⁾日本生物科学研究所、⁴⁾京都大学大学院医学研究科
第47回日本移植学会総会、2011年 　
要旨：医用動物臓器をドナーとする異種移植は、ドナー臓器不足に対する有力な解決策となる。臨床応用を目指したブタ･サル間の異種移植研究に着手し、超急性拒絶反応の標的であるα-Galを発現しないGalT（α-1, 3-galactosyltransferase）ノックアウト（GalT-KO）ブタの細胞核を用いた核移植技術によって、国内でGalT-KOブタを作出するという大きな成果を得た。Gal抗原の発現がないことをIB4染色で確認した、この国産GalT-KOブタを使用し、（1）サルへの国内初の異種腎移植で15日間拒絶を認めない、（2）体外灌流を用いたex-vivoブタ肺移植で（ブタ肺を異種ヒト血液で灌流）、GalT-KOブタ肺が急性期の肺機能不全を回避しうる結果を得た。更に、異種膵島移植では、通常のクラウンミニブタを使用し、（3）Streptozotocinにより糖尿病を誘発したサルへのブタ膵島移植で、当研究室が確立した新規の免疫制御療法であるHGF
（Hepatocyte growth factor）併用により2か月間の正常血糖制御が可能、という国内初の成果を得た。今後、新たな免疫制御法の探索や、GalT-KOに拒絶制御のための遺伝子導入を加えたGalT-KO改良ブタの作成を通じ、臨床応用に直結可能な各種異種臓器移植の実験をすすめていく方針である。

α-1, 3-ガラクトース転移酵素遺伝子ノックアウト（GalT-KO）ミニブタの作出．

島津美樹
日本生物科学研究所
先進医用ブタの開発と前臨床研究拠点形成プロジェクト第2回公開シンポジウム：ブタの医用動物への展開、2012年
要旨：異種動物からヒトへの臓器移植は、生体の持つ免疫機能が解明されていない1900年代より検討され、1950〜1960年代にはヒトからの移植も開始された。90年代に入ると、倫理的問題、感染症の危険性から霊長類からではなくブタからの臓器移植が試みられるようなったが、数分から数時間で移植臓器が拒絶される超急性拒絶反応が大きな障害となった。しかし、その原因がブタに発現するガラクトース-α1, 3-ガラクトースとよばれる糖鎖抗原に対するヒトの自然抗体の存在にあることが解明され、2000年の核移植技術によるクローンブタの作出成功により、世界各国のさまざまな研究機関でα1,3-ガラクトース転移酵素遺伝子ノックアウト（GalT-KO）ブタの作製が行われるようになった。GalT-KOブタ誕生により、異種臓器移植の臨床応用への道程は飛躍的に前進したといっても過言ではない。（財）日本生物科学研究所では、2007年度から鹿児島大学フロンティアサイエンス研究推進センターの山田和彦教授らの研究グループと共同でGalT-KOミニブタの作出を目指し研究を進めてきた。具体的な手法としては、既に米国で確立され信頼性のあるマサチューセッツ総合病院GalT-KOミニブタの細胞をブタ体外成熟卵子に核移植した。その後、当研究所において確立したNIBS（Nippon Institute for Biological Science）系ミニブタに開腹下でクローン胚の移植を行い、GalT-KOミニブタを誕生させた。本日は、GalT-KOミニブタの作出の経緯を紹介する。

Avian stem cell for regeneration of muscular dystrophy chickens by means of germline chimeras.

Fujiwara, A.¹⁾, Mizutani, M.²⁾, Nunoya, T.¹⁾, Hiramatsu, K.³⁾, Ono, T.³⁾
and Kagami, H.^3)
1)Nippon Institute for Biological Science,
²⁾Avian Bioscience Research Center, Nagoya University,
³⁾Faculty of Agriculture, Shinshu University
2012 International Symposium on Animal Biotechnology, Shinshu University
Abstract: The offspring were generated from germline chimera between muscular dystrophy chicken; NH-413 strain (donor), and White Leghorn L-M (recipient). Phenotype and symptom of type-I offspring were quite similar to that of the NH-413 strain. In type-II offspring, feather color showed mixture of white and brown and the symptom was not dominantly indicated. Sexually matured males and females of the type-I were mated each other. Chickens manifesting completely same phenotype to that of the donor Nh-413 strain; brown feather color and symptom of muscular dystrophy, were regenerated from the mating. These results suggested that complete regeneration of the muscular dystrophy chickens could be generated by fertilization of spermatozoa and ovum derived from donor cells. Statics such as fertility, hatchability and survival rate of these regenerated offspring were significantly increased as compared to that of the original NH-413 strain. from these results, it was concluded that the novel strategies to regenerate chickens with muscular dystrophy was developed.

Muscular dystrophic chicken is the hypernatremia.

Saito, N.^1,2), Hirayama, H.²⁾, Yoshimura, K.²⁾, Atsumi, Y.¹⁾, Kinoshita, K.¹⁾, 
Mizutani, M.¹⁾, Fujiwara, A.³⁾, Namikawa, T.¹⁾ and Aste, N.^2)
1)Avian Bioscience Research Center, Nagoya University,
²⁾Laboratory of Animal Physiology, Nagoya University,
³⁾Nippon Institute for Biological Science
8th International Congress of Comparative Physiology and Biochemistry, 2011
Abstract:The muscular dystrophy chicken has been studying as model animal of muscular dystrophy for more than 50 years. Recently, the mutation of WW domain containing E3 ubiquitin protein ligase 1 (WWP1) gene has been identified as a responsible for muscular dystrophy chicken. We observed that muscular dystrophy chicken not only showed the degeneration of skeletal muscles but also produced watery feces. Therefore, we examined the possibility of abnormalities n water metabolism of muscular dystrophy chicken. We first analyzed plasma osmolality and gene expression of aquaporin 2 (AQP2), AQP3 and alpha subunit of the amiloride-sensitive epithelial sodium channel (αENaC) in muscular dystrophy chicken and White Leghorn chicken under normal phiysiological conditions at five-week old. Subsequently, we analyzed these same parameters after one-day water-deprivation. The main findings of our study are that: I) the plasma osmolality was significantly higher in muscular dystrophic chicken than in White Leghorn; II) kidneyαENaC mRNA expression was significantly lower in muscular dystrophic chicken than in White Leghorn; III) AQP2 and AQP3 mRNA expressions in muscular dystrophic chicken were similar in White Leghorn. We suggest that the mutation of WWP1 may cause the abnormality of sodium absorption, and thus muscular dystrophic chicken become hypernatremic.

ニホンウズラにおけるトリインフルエンザ責任遺伝子Mxに関する研究.

朝治桜子¹⁾、鈴木進悟²⁾、水谷誠³⁾、藤原哲⁴⁾、原ひろみ¹⁾、吉田豊¹⁾、椎名隆²⁾、半澤恵^1)
1)東京農業大学農学部、²⁾東海大学医学部、³⁾名古屋大学農学部、⁴⁾日本生物科学研究所
第115回日本畜産学会、2012年
要旨：Mx遺伝子はミクソウイルス抵抗性に関する抗病性遺伝子である。ニワトリMxタンパク質705個のうち631番目のアミノ酸がアスパラギンの場合は鳥インフルエンザウイルス（AIV）に対して抵抗性を、セリンの場合は感受性を示す。一方、ニワトリの近縁種であるニホンウスラはAIVに対する感受性がニワトリとは異なることが示唆されている。本研究は、ニホンウズラMxの基礎的知見を得ることを目的とした。まず、ニワトリMx遺伝子21kbの塩基配列を元にMHC HTが固定されているニホンウズラゲノムDNAを用いてダイレクトおよびショットガンシークエンスにより解析した。その結果、ニホンウズラMx遺伝子のCDS領域、ならびに3つのゲノムコンディング：イントロン1の一部からエキソン5まで、エキソン6およびイントロン6の一部からエキソン14まで計16348bpの塩基配列を決定した。その結果、CDS配列、そこから推定されるアミノ酸配列ならびにエキソンーイントロン構造が、いずれもニワトリおよびその他キジ科鳥類と相同であることを明らかにした。ついで、類縁関係のある3系統、31個体のニホンウズラのゲノムDNAを対象にMxのアミノ酸配列631番目に相当するニホンウズラMxの634番目のアミノ酸を確認したところ全てセリンとなり、AIVに感受性であることが示唆された。

代理卵殻によるコリンウズラ胚の培養の検討.

代理卵殻を用いたコリンウズラ胚培養法の樹立とコリンウズラ、
ウズラ異科間キメラ作出の試み.

加藤淳¹⁾、杉山礼央奈¹⁾、鶴田祐理¹⁾、宮原大地¹⁾、渥美優介²⁾、藤原哲³⁾、鏡味裕¹⁾、
小野珠乙^1)
1)信州大学農学部、²⁾名古屋大学鳥類バイオリソース研究センター、³⁾日本生物科学研究所
日本家禽学会春季大会、2012年
要旨：【目的】いわゆる「ウズラ」と呼称されている種は、系統発生的にウズラ（Coturnix japonica：JP）等の旧世界ウズラとコリンウズラ（Coturnix virginianus: CV）等の新世界ウズラに分類される。実験動物は目的に応じて多くの種が用意されることが望ましいが、これまでに新世界ウズラを用いた発生学的な研究は十分になされていない。そこで本実験では、新世界に属するCVにおいて、基礎的な生物学的データを得るために、代理卵殻を用いた培養法の樹立と、CV-JP異科間キメラの作出を試みた。[方法]CV胚の培養は、JP胚の二段階培養法（Ono et al., 1994）を一部改変し、以下の条件で、生存率、孵化率を比較した。①第一段階の培養時間
（50～53、63～65時間）、②培養液｛ニワトリ（Ch）, JP, CV水様性卵白｝、③培養時の明暗、④第二段階の代理卵殻（Ch約45g, Ch約38g, 約25g, Ch約15g）、⑤第一段階の代理卵殻
（JP 約15g）を孵化まで用いる培養法の簡略化。さらに、CV胚培養法を活用して、伴性劣性アルビノウズラ（AL）胚盤葉解細胞をCV胚に導入した。【結果】各条件下で良い孵化率が得られたのは以下の群であった。①培養時間63～65時間群｛27.6％（27/98）vs. 13.5％（7/52）；P< 0.05｝。②Ch培養液群｛27.6％（27/98）vs. 4.8%（3/62, JP）, 0%(0/45, CV); P<0.01｝。③明暗には差がなかった（25.9～30.0％）。④代理卵殻はCh約38g, JP約15gにおいて孵化率｛39.0％（23/59）vs. 37.0%（27/73）｝と比較的良好であったが、有意差は認められなかった（25.5～39.0%）。⑤簡略化群では孵化率31.4％（16/51）であった。また、キメラ胚（23日胚）においてドナー由来の羽装が確認され、さらに、ドナー由来の増幅産物が検出された。以上の結果より、二段階培養法におけるJP卵殻の可能性が示され、CV胚培養における好適な培養条件が示された。さらに、新世界ウズラに属するCVにおいて、新たな知見が得られ、CVの実験動物としての有用性が増大したと考えられる。

ニホンウズラCD1遺伝子領域の多様性解析.

ニホンウズラMx遺伝子の構造解析.

朝治桜子¹⁾、飯島祐太¹⁾、鈴木進悟²⁾、椎名隆²⁾、水谷誠³⁾、藤原哲⁴⁾、原ひろみ¹⁾、吉田豊¹⁾、
半澤恵^1)
1)東京農業大学農学部、²⁾東海大学医学部、³⁾名古屋大学農学部、⁴⁾日本生物科学研究所
第34回日本分子生物学会年会、2011年
要旨：Mx遺伝子は、ミクソウイルスに対して抵抗性を示す代表的な抗病性遺伝子である。ニワトリのMx遺伝子は705個のアミノ酸で構成されているが、そのうち631番目のアミノ酸がアスパラギン（Asn631）の場合は鳥インフルエンザウイルスに対して抵抗性を示し、セリン
（Ser631）の場合は感受性を示すことから、Mx 遺伝子はニワトリのインフルエンザウイルスに対する感受性を規定する遺伝子の一つであるとされている。しかし、ニワトリを除く他鳥類においてMx 遺伝子の構造は解析されていない。一方、ニワトリの近縁種であるニホンウズラはインフルエンザウイルスに対する感受性が異なることが示唆されている。そこで本実験では、ニホンウズラのMx 遺伝子のゲノム構造を明らかにし、ニワトリMx遺伝子と比較解析することを目的とした。MHCハプロタイプが決定されているニホンウズラのゲノムDNAを用い、ニワトリでは全21kbにおよぶMx 遺伝子を網羅するPCR系の開発し、PCR産物のショットガンシークエンシングおよびダイレクトシークエンシングにより塩基配列の決定を進めている。現在までに、Mx 遺伝子のエクソン1およびエクソン2の周辺とイントロン5〜エクソン14に相当する計12kbの塩基配列の決定を決定した。ニホンウズラとニワトリのエクソン2の類似性は71％と低かったが、両者のエクソン7〜14は83〜98％と高値を示した。一方、両者のイントロン領域の類似性は76〜90％であったが、ニホンウズラMx のイントロン1の3’末にはニワトリMx に比べて2.5kbの欠損が認められた。また、類縁関係のある2系統、15個体のニホンウズラのゲノムDNAを用いてMx の631番目のアミノ酸を推定したところ全てセリンとなり、インフルエンザウイルスに感受性であることが示唆された。今後、ニホンウズラMx 遺伝子の全領域の塩基配列を決定し、エクソンを特定するためにcDNA塩基配列を確認するとともに、さらにニホンウズラ各種系統を対象にMx の多型性について調査する。